/

Wyhodować raka w laboratorium

avatar
Dr Ewa Krawczyk 7 Sty, 5 minut czytania

Linie komórkowe, hodowle komórek rosnących bezproblemowo w laboratoriach, in vitro, jako tzw. monolayer (czyli pojedyncza warstwa komórek, hodowla w 2D) mają ogromne zasługi dla rozwoju wielu dziedzin nauk biologiczno-medycznych. Bez linii komórkowych niemożliwe by były (a przynajmniej byłoby to bardzo utrudnione, a całość wyglądałaby zapewne inaczej) badania prowadzące do stworzenia szczepionek, produkcja i testowanie potencjalnych leków zanim te trafią do pacjenta, testy diagnostyczne, a także najróżniejsze badania różnorodnych mechanizmów biologicznych i biochemicznych, zachodzących na poziomie komórkowym, subkomórkowym i molekularnym. Także w przypadku onkologii ustabilizowane w hodowli linie komórkowe oddały nieocenione usługi tej gałęzi medycyny.

Obecnie jednak istnieje silny trend odwrotu raczej od linii komórkowych, szczególnie tych ustabilizowanych, nieśmiertelnych, rosnących w sposób nieprzerwany, oraz nacisk na poszukiwanie innych modeli nowotworzenia i raka. Okazuje się bowiem, że rosnące w nieskończoność linie komórkowe (przykładem mogą być komórki HeLa, uzyskane od pacjentki z rakiem szyjki macicy jeszcze w latach 50. XX wieku) nie ukazują wiernie tego, co dzieje się w organizmie pacjenta. Podczas wielokrotnych pasaży takich komórek w laboratoriach dochodzi do nagromadzenia nowych mutacji, ponadto standardowe linie komórkowe nie oddają skomplikowanego poziomu struktury i funkcjonowania danego nowotworu. Co po prostu oznacza, że naukowcy tak naprawdę nie pracują z czymś, z czym by chcieli, ale z czymś o zupełnie innych cechach. Można próbować obejść ten problem i stosować tzw. pierwotne linie komórkowe, czyli takie, które uzyskane są bezpośrednio z organizmu pacjenta – często są one jednak bardzo trudne do utrzymania przy życiu przez długi czas (szczególnie te normalne, niezbędne do zastosowania jako kontrola dla komórek nowotworowych). Można oczywiście obejść i ten kłopot za pomocą wprowadzenia do takich komórek odpowiednich genów, które sprawią, iż komórki staną się nieśmiertelne (inaczej immortalizowane; stosuje się w takim wypadku na przykład geny wirusowe czy komórkowe, np. SV40 large T antigen, czy katalityczną podjednostkę telomerazy, hTERT). Takie manipulacje prowadzą jednak do narastającej niestabilności genomu komórki i utraty tych cech biologicznych i genetycznych, które charakteryzowały tkankę, z której komórki były pobrane. Jednakże należy podkreślić, iż unieśmiertelnione za pomocą transdukcji genów komórki bywają bardzo użyteczne. Przykład na Ryc.1:

Ryc. 1. Z lewej: hodowla in vitro komórek nabłonka szyjki macicy, unieśmiertelnionych za pomocą dwóch onkogenów wirusa brodawczaka HPV (E6 i E7), wykazujących ekspresję wirusowego białka E5; barwienie hematoksyliną/eozyną (H&E). Z prawej: hodowla in vitro immortalizowanych (dzięki SV40 large T antigen) komórek COS, do których wprowadzono gen onkoproteiny E5 wirusa HPV; zielone barwienie fluorescencyjne pokazuje umiejscowienie E5 w retikulum endoplazmatycznym i aparacie Golgiego. Pokazane na zdjęciach linie komórkowe pozwoliły na zbadanie różnych mechanizmów biologicznych i zjawisk zachodzących w komórkach pod wpływem wirusów brodawczaka, w tym koilocytozy i subkomórkowej lokalizacji białka E5. Zdjęcia pochodzą z kolekcji „2016 NCI Cancer Close Up”, autorka: Ewa Krawczyk, domena publiczna.

Mamy zatem obecnie sytuację, gdy palącym problemem jest znalezienie wiernego modelu in vitro do badania nowotworu/ów, który jak najdokładniej odwzoruje to, co dzieje w się w organizmie pacjenta, który w dodatku pozwoli na długotrwałą pracę badawczą bez akumulowania niepożądanych zmian w komórkach, będzie także niezbyt trudny technicznie, oraz niedrogi. Nie jest to łatwe zadanie, ale są już w tej dziedzinie pewne osiągnięcia. Dwa stosunkowo niedawno opublikowane dokonania uważane są za znaczący i potencjalnie ogromny postęp w dziedzinie badań podstawowych, przedklinicznych, a także mający wpływ na kliniczne badania nowotworów. Dokonania te, określane w piśmiennictwie specjalistycznym jako „przełom”, „kamienie milowe” oraz idealny przykład zastosowania tzw. medycyny spersonalizowanej, nastawionej na leczenie konkretnego pacjenta, to tzw. organoidy (twórcą metody jest Hans Clevers i jego zespół z Hubrecht Institute w Holandii) oraz nowa metoda re-programowania komórek (tzw. warunkowe reprogramowanie komórek, ang. Conditional Cell Reprogramming, CCR), opracowana przez zespół Richarda Schlegela z Georgetown University w Stanach Zjednoczonych. Obie metody mają szczególne znaczenie w przypadku badania nowotworów i raków rzadkich, gdzie do zwykłych problemów z liniami komórkowymi dochodzi jeszcze fakt, że liniami takimi, mniej lub bardziej użytecznymi, zwyczajnie nie dysponujemy.

Ryc. 2. Komórki raka piersi hodowane metodą warunkowego reprogramowania. Barwienie fluorescencyjne, czerwony kolor uwidacznia MHC-I, niebieski – jądra komórkowe. Zdjęcie pochodzi z kolekcji „2016 NCI Cancer Close Up”, autorka: Ewa Krawczyk, domena publiczna.

Warunkowe reprogramowanie jest hodowlą komórek w 2D (Ryc. 2) przez nieskończony czas, w odpowiednich warunkach: specjalnie dobranym podłożu hodowlanym i z towarzyszącymi im odpowiednio przygotowanymi innymi komórkami, mysimi fibroblastami. Komórki w hodowli są unieśmiertelnione, mogą żyć i namnażać się bez końca, ale nie wymagają do tego wprowadzenia żadnych dodatkowych genów. Ich genom jest stabilny, komórki mnożą się szybko, nie różnicują się ani nie starzeją, i co ważne – zachowują swoje tkankowe właściwości (czyli po usunięciu warunków sprzyjających reprogramowaniu, wracają do oryginalnego programu rozwojowego – Ryc. 3), a także zróżnicowany skład reprezentowanego nowotworu. Metodę CCR stosuje się już obecnie w wielu laboratoriach na świecie, a używana może być do celowego dobierania terapii dla pacjentów, testowania leków (bo umożliwia hodowlę komórek zarówno nowotworowych, jak i normalnych, pobranych od tej samej osoby, co gwarantuje optymalną kontrolę testów), badań nad nowotworami rzadkimi, badań nad komórkami i nowotworami pochodzącymi od zwierząt i modeli zwierzęcych, a także na tworzenie banków komórek, przydatnych m.in. do zakrojonych na bardzo dużą skalę badań przyszłych terapii przeciwnowotworowych. Metoda jest łatwa technicznie, bardzo wydajna i niedroga. Wadami jej są m.in.: stosowany przy niej czynnik chemiczny (Y-27632, inhibitor kinazy ROCK) wpływać może na niektóre testy biologiczne, ponadto kiedy mamy do czynienia z mieszanką pobranych od pacjenta komórek normalnych i nowotworowych (co jest sytuacją nierzadką), może nastąpić selekcja w kierunku wzrostu komórek normalnych.

Ryc. 3. Ludzkie komórki nabłonkowe pochodzące z szyjki macicy w hodowli 3D (tzw. air-liquid interface), barwienie H&E. Komórki, po licznych pasażach hodowli metodą warunkowego reprogramowania, zachowują swój rozwojowy potencjał rosnąc in vitro w postaci wielowarstwowego nabłonka. Zdjęcie pochodzi z kolekcji „2016 NCI Cancer Close Up”, autorka: Ewa Krawczyk, domena publiczna.

Druga wspomniana technika, metoda hodowli komórek w postaci tworzenia organoidów (czyli „mini-narządów”, zminiaturyzowanej wersji narządów in vitro) ma taką zaletę, i przewagę nad CCR, że pozwala obserwować i badać komórki w 3D, dzięki czemu lepiej odwzorowuje strukturę i heterogenność nowotworu i/lub narządu. Technika jest wyjątkowo przydatna do obserwacji poszczególnych faz rozwoju nowotworu, do badania jego najwcześniejszych stadiów, do identyfikacji miejsc docelowych działania leków, a także do badania oporności na leki. Komórki hodowane w ten sposób są stabilne genetycznie, mogą rosnąć przed dłuższy czas, można na nich wykonywać najróżniejsze modyfikacje genetyczne, mogą też być zastosowane w medycynie spersonalizowanej i regeneracyjnej, ze względu na możliwość hodowli komórek i nowotworowych, i normalnych. Z ich użyciem możliwe są również testy nowych leków, jednakże na małą raczej, niż dużą skalę. Drugą wadą jest to, że metoda jest dość trudna technicznie.

Warto podkreślić, że obie powyżej opisane metody, CCR i organoidy, nie stanowią konkurencji (choć czasem bywają tak przedstawiane), a mogą się – i powinny – raczej uzupełniać w celu jeszcze lepszego odwzorowania tego, co dzieje się w ciele pacjenta.

Więcej informacji:

  1. Ben-David U et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature 2018; 560: 325
  2. Boehm JS, Golub TR. An ecosystem of cancer cell line factories to support a cancer dependency map. Nature Reviews Genetics 2015; 16: 373
  3. Boj SF et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell 2015; 160: 324-338
  4. Kamb A. What’s wrong with our cancer models? Nature Reviews Drug Discovery 2005; 4: 161
  5. Kondo J, Inoue M. Application of Cancer Organoid Model for Drug Screening and Personalized Therapy. Cells 2019, 8, 470
  6. Krawczyk E et al. Koilocytosis: a cooperative interaction between the human papillomavirus E5 and E6 oncoproteins. Am J Pathol. 2008; 173: 682-688
  7. Krawczyk E et al. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 2010; 84: 1696-1703
  8. Krawczyk E et al. Murine neuroblastoma cell lines developed by conditional reprogramming preserve heterogeneous phenotypes observed in vivo. Lab Invest. 2020; 100: 38-51
  9. Liu X, Krawczyk E et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nat Protoc. 2017; 12: 439-445
  10. Mahajan AS et al. Genomic comparison of early-passage conditionally reprogrammed breast cancer cells to their corresponding primary tumors. PLoS One. 2017; 12: e0186190
  11. Moorefield EC et al. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology 2018; 19: 15
  12. Namekawa T et al. Application of Prostate Cancer Models for Preclinical Study: Advantages and Limitations of Cell Lines, Patient-Derived Xenografts, and Three-Dimensional Culture of Patient-Derived Cells. Cells 2019, 8, 74
  13. Palechor-Ceron N et al. Conditional Reprogramming for Patient-Derived Cancer Models and Next-Generation Living Biobanks. Cells 2019, 8, 1327
  14. Rotkiewicz M. Testowanie leków na raka in vitro. Wywiad z dr Ewą Krawczyk. Polityka, 12 MARCA 2013. Dostęp online: 31/10/2019,https://www.polityka.pl/tygodnikpolityka/nauka/1537347,1,testowanie-lekow-na-raka-in-vitro.read.
  15. Sachs N, Clevers H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr. Opin. Genet. Dev. 2014; 24: 68–73
  16. Senft D et al. Precision Oncology: The Road Ahead. Trends in Molecular Medicine 2017; 23: 874
  17. Shamir ER, Ewald AJ. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2014; 15: 647–664
  18. Sharifnia T et al. Emerging Opportunities for Target Discovery in Rare Cancers. Cell Chemical Biology 2017; 24: 1075
  19. Suprynowicz FA et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109: 20035-20040
  20. Tuveson D, Clevers H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science 2019; 364: 952-955
  21. Wilding JL, Bodmer WF. Cancer Cell Lines for Drug Discovery and Development. Cancer Res. 2014; 74: 2377
  22. Williams SP, McDermott U. The Pursuit of Therapeutic Biomarkers with High-Throughput Cancer Cell Drug Screens. Cell Chemical Biology 2017; 24: 1066
  23. Yuan H et al. Use of Reprogrammed Cells to Identify Therapy for Respiratory Papillomatosis. N Engl J Med 2012; 367: 1220-1227

 

Podziel się: