/

Wirus SARS-CoV-2. Genetyka i diagnostyka dla wtajemniczonych.

avatar
dr Maciej Dąbrowski 31 Mar, 7 minut czytania

Koronawirusy

Koronawirusy to liczna rodzina wirusów, zwykle powodujących łagodne do umiarkowanych choroby górnych dróg oddechowych, m.in. popularne przeziębienia. Nie wzbudzały one wielkiego zainteresowania epidemiologów, aż do początku XXI wieku, kiedy to aż trzy razy doszło do wybuchu epidemii o zasięgu międzynarodowym, wywołanych właśnie przez te wirusy. Większość koronawirusów posiada swój rezerwuar wśród zwierząt: świń, kotów, wielbłądów czy nietoperzy. W niektórych przypadkach mogą one infekować również ludzi. Obecnie znamy 7 koronawirusów wywołujących choroby u człowieka, z czego najgroźniejsze to: SARS-CoV (wywołujący zespół cieżkiej ostrej niewydolności układu oddechowego), MERS-CoV (bliskowschodni zespół oddechowy) oraz SARS-CoV-2 wywołujący znaną już wszystkim chorobę COVID-19.

Jeden z krewniaków obecnego wirusa SARS-CoV-2, wirus SARS-CoV pojawił się nagle w Chinach w 2002 roku. Jego epidemia przetoczyła się po całym świecie, zachorowało wówczas ponad 8000 osób, a 774 zmarło1. Wirus i wywoływana przez niego choroba zniknęły w 2004 roku, prawdopodobnie na skutek skutecznej izolacji osób chorych oraz tych z podejrzeniem choroby. Następnie w 2012 roku pojawił się kolejny niebezpieczny koronawirus, tym razem na Bliskim Wchodzie, w Arabii Saudyjskiej. Był to MERS-CoV, wywołujący chorobę o zbliżonych objawach do SARS, jednak o znacznie wyższej śmiertelności. I w tym przypadku udało się powstrzymać globalne rozprzestrzenianie się epidemii, choć wirus nadal jest często wykrywany u wielbłądów.

W grudniu 2019 roku w Chinach zaczęto odnotowywać liczne przypadki zachorowania na ostre wirusowe zapalenie płuc w rejonie miasta Wuhan. Chorobą nazwano COVID-19. W ciągu pierwszych dwóch miesięcy liczba zainfekowanych osób przekroczyła liczbę chorych na SARS w latach 2002-2003. Epidemia wirusem SARS-CoV-2 szerzy się obecnie na całym świecie i trudno przewidzieć jej dalszy rozwój. Obecne modele matematyczne nie napawają optymizmem, w związku z tym nie zostaje nam nic innego jak poznać swojego wroga.

SARS-CoV-2

Wirus SARS-CoV-2 podobnie jak SARS-CoV i MERS-CoV wywodzi się prawdopodobnie od wirusów nietoperzy. Zwierzęta te mają zdolność do tolerancji najróżniejszych wirusów, co czyni je tyglem genetycznym generującym nowe mutacje lub nawet całkowicie nowe wirusy. Jednak to nie nietoperze były wektorem pierwszych zakażeń. W przypadku SARS zwierzęciem, które przekazało chorobę ludziom były łaskuny palmowe, niewielkie nocne ssaki; z kolei MERS przeskoczył na człowieka z wielbłądów. Nadal nie znamy wektora zwierzęcego dla COVID-19, choć część badań wskazuje na łuskowce, masowo pozyskiwane w Chinach do produkcji preparatów medycyny tradycyjnej.

Koronawirusy to średniej wielkości RNA wirusy, z materiałem genetycznym o długości ok 30 kb w postaci jednej nici1. Sekwencjonowanie genomu wirusa SARS-CoV-2 wykazało podobieństwo w 87% z wykrywanymi u nietoperzy SARS-podobnymi betakoronawirusami2. Mimo licznych podobieństw, genom wyraźnie odróżnia go od SARS-CoV i MERS-CoV, i tworzy osobną linię w podrodzaju sarbekowirusów3. Organizacja genomu jest dość typowa dla betakoronawirusów, składa się z regionu niepodlegającemu translacji 5’ (5’ UTR), kompleksu replikazy (orf1ab), regionów kodujących białka S, E, M, N; 3’ UTR oraz kilka nie do końca zidentyfikowanych, otwartych ramek odczytu(ORF)4.

Głębsza analiza porównawcza dwóch regionów kodujących niezwykle istotne białka wirusowe: N (białko nukleokapsydu) i S (kodującego kolco-podobną nukleoproteinę powierzchniową) wykazała liczne różnice w stosunku do SARS-CoV i MERS-CoV. Białko strukturalne N odpowiada za składanie wirionu i odgrywa kluczową rolę w transkrypcji wirusa i efektywności jego składania. Z kolei od drugiego białka, białka S, wzięła się nazwa tej grupy wirusów. Kolczaste wypustki na powierzchni kapsydu skojarzyły się naukowcom z koroną – stąd termin koronawirusy. Białko S odpowiada za wnikanie wirusa do wnętrza komórki po połączeniu z ludzkim receptorem powierzchniowym ACE2, prowadząc do fuzji z błoną komórkową – są to dwa kluczowe etapy infekcji wirusowej. Receptory ACE2 znajdują się na powierzchni komórek nabłonkowych jamy ustnej, języka oraz komórek nabłonka oddechowego (między innymi komórek orzęsionych i pęcherzyków płucnych)5. To właśnie te rodzaje komórek są atakowane przez SARS-CoV-2 i w ich cytoplazmie dochodzi do replikacji materiału genetycznego wirusa. Mutacje w opisanych wyżej rejonach mogą tłumaczyć wysoką infekcyjność (większą niż nietoperzo-pochodnych wirusów SARS) oraz niższą patogenność niż ludzki wirus SARS. Obie te cechy wpływają na łatwość w globalnym rozprzestrzenianiu się COVID-193.

Porównując genomy SARS-CoV-2 wyizolowane od różnych pacjentów wykazano bardzo dużą homologię (powyżej 99,99%) zarówno na poziomie nukleotydowym jak i aminokwasowym. Co oznacza, że wirus ten nie ma tendencji do szybkiego mutowania. Niemniej, wykryto w niektórych rejonach ORF pojedyncze mutacyjne hot-spoty czyli miejsca w których dochodzi do częstych zmian (między innymi w regionach kodujących S i N). Oznacza, że należy wykazać się czujnością projektując testy diagnostyczne identyfikujące COVID-19 oraz tłumaczy część przypadków wyników fałszywie negatywnych w diagnostyce (gdzie nie wykryto wirusa mimo zakażenia)6. Nie można wykluczyć, że w przyszłości dojdzie do kolejnych mutacji w tych genach za pomocą mechanizmu selekcji pozytywnej, prowadzącej do powstania jeszcze groźniejszej formy SARS-CoV-2. Co więcej, jeśli dojdzie do zakażenia jednej komórki dwoma różnymi wirusami, koronawirusy wykazują zdolność do genetycznej rekombinacji (wymiany materiału genetycznego).

Czy SARS-CoV-2 powstał w laboratorium?

Od pewnego czasu krąży w mediach społecznościowych i na portalach plotkarskich hipoteza jakoby wirus SARS-CoV-2 był bronią biologiczną wyprodukowaną w chińskich laboratoriach lub odwrotnie, że został stworzony przez amerykańską armię by zaszkodzić chińskiej gospodarce. W odpowiedzi na te pseudo-teorie powstało kilka publikacji naukowych, które analizując genom wirusa oraz śledząc jego ewolucję jednoznacznie wykazały, iż SARS-CoV-2 powstał w naturalny sposób bez ingerencji człowieka7–9

Diagnostyka zakażeń SARS-CoV-2

Jeśli chodzi o diagnostykę zakażeń wirusem SARS-CoV-2 to obowiązują dwie strategie diagnostyczne detekcji: serologiczna i molekularna.

a ) metody serologiczne: wykrywanie przeciwciał klasy IgM i IgG.

Opierają się one na testach ELISA oraz immunochromatografii (testy paskowe/kasetkowe). Są one tanie i szybkie (od 20zł, badanie z krwi np. z opuszka, ok 10min do otrzymania wyniku). Niestety testy te nie są rekomendowane przez żadne poważne instytucje- zarówno międzynarodowe (WHO, CDC) jak i krajowe (PZH, KIDL, NIL). Mogą być one traktowane jako pomocnicze i nie bez powodu- są one testami późnymi, mediana czasu od zakażenia do wytworzenia przeciwciał wynosi ponad 10 dni. Co więcej, u osób w immunosupresji: zarażonych HIV, po chemioterapii, transplantacji lub w przebiegu chorób z autoagresji lub chorób rozrostowych układu krwiotwórczego badanie serologiczne może dać wynik fałszywie ujemny z uwagi na upośledzoną produkcję przeciwciał odpornościowych. Ponadto z uwagi na wciąż małą znajomość taksonu Betacoronaviridae, trudno jest przewidzieć występowanie reakcji krzyżowych pomiędzy przeciwciałami SARS-COV-2 a innymi  koronawirusami dróg oddechowych: NL63, 229E, OC43, HKU1, FIPV, SARS-CoV, MERS-CoV, MG10, IBV. Nie było dotychczas możliwości zwalidowania tych testów rzetelnie pod kątem specyficzności analitycznej.

b) metody molekularne bazujące na Real-Time PCR (rRT-PCR), będące testami rutynowymi i z wyboru w diagnostyce zakażeń SARS-CoV-2. Wykrywają one co najmniej 2 amplikony specyficzne dla tego wirusa. Lepsze testy wyposażone są jeszcze w trzeci amplikon wirusowy lub kontrolę izolacji i amplifikacji. Testy Real-Time pozwala na detekcję zakażenia już przed 7 dniem, ale optymalną czułość zyskują między 7 a 14 dniem od zakażenia.

Później zanika replikacja wirusa w drogach oddechowych. Niemniej jednak w obecnej sytuacji najistotniejsze jest wykrycie infekcji jak najwcześniej, w fazie przedobjawowej lub skąpoobjawowej, stąd wytyczne WHO jasno zalecają jako podstawę diagnostykę molekularną.

Wadą testu jest praco- i czasochłonność oraz koszt, od ok 150 do ok 450zł. W praktyce czas trwania badania jest uzależniony nie tylko od rodzaju posiadanego testu ale także od czasu przyjęcia materiału, izolacji RNA i uzbierania puli pacjentów (w przypadku metod manualnych), czasu wykonania samej reakcji i jej analizy (3h) oraz wydania wyniku. Jest to średnio 6-24h, zależnie od obsady laboratorium i posiadanego sprzętu.

Nowością w diagnostyce COVID-19 są testy oparte o izotermiczną amplifikację, które są szybsze i nie wymagają termocyklera, a jedynie blok grzejny. Dotychczas pojawił się jeden tego typu test komercyjny, pracuje jednak nad nimi wiele kolejnych firm.

 

Rodzaje testów molekularnych

Liczba testów molekulanych w diagnostyce COVID-19 wydłuża się z dnia na dzień, stąd nie sposób opisać ich wszystkich. Jest ona stale aktualizowana na stronie https://www.360dx.com/coronavirus-test-tracker-launched-covid-19-tests. Można wyróżnić 3 kategorie testów molekularnych, które wykonuje się w laboratoriach diagnostycznych:

  1. Testy automatyczne

Obecnie istnieje szeroka gama systemów automatycznych do analizy wirusowego RNA. Samodzielnie prowadzą one lizę materiału od pacjenta, izolację RNA i reakcję rRT-PCR. Niektóre także mają możliwość opracowania wymazu i wymagają jedynie włożenia wymazówki do maszyny, inne wymagają wstępnej lizy próbki wykonanej przez pracownika laboratorium. Są to najczęściej rozwiązania niskoprzepustowe (np. ELITe Ingenius, Cepheid Genexpert, Abbott ID-Now), choć powstają też wielkie analizatory (Roche Cobas 6800/8800, Cepheid GeneXpert Infinity). Obiecującym testem działającym bez laboratorium, w systemie tzw. przyłóżkowym (ang. POCT, point-of-care-test) jest test firmy Abbott ID-Now, który wykorzystuje izotermiczną amplifikację i podobno umożliwia wykonanie całej analizy w kilkanaście minut. Jest to jednak test analizujący jedną próbkę naraz.

  1. Testy komercyjny manualne

Są to gotowe zestawy odczynników działające na klasycznych termocyklerach. Wymagają najczęściej wstępnego etapu izolacji RNA. Odczynniki są zmieszane w formie gotowego tzw. mixu, wystarczy go rozpipetować, dodać próbkę i wstawić do konwencjonalnego cyklera real-time. Testy manualne wymagają zdecydowanie większego nakładu pracy, są jednak wystandaryzowane i można je jednocześnie wykonać nawet dla 96 próbek (a nawet wielokrotności tej liczby, zależnie od rodzaju urządzenia do amplifikacji).

  1. Testy manualne, opracowane w laboratorium (tzw. „in-house”)

Najtańsze, możliwe do zastosowania na największą skalę ale wymagające najwięcej pracy i ostrożności są testy niecertyfikowane, opracowane w laboratoriach diagnostycznych. Jak każde badanie real-time PCR, także i detekcja wirusowego RNA polega na dodaniu do siebie odwrotnej transkryptazy, polimerazy, sond i starterów PCR. Można to zrobić z użyciem dowolnego zestawu ‘one-step’ do rRT PCR oraz publicznie dostępnych oligonukleotydów (rekomendowanych przez WHO, https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance). Należy jednak zgodnie z prawem polskim i unijnym dowieść, że nasz test działa równie dobrze co komercyjny. Robi się to poprzez porównanie wyników dla naszego testu i innego, dostępnego komercyjnie, bądź poprzez porównanie wyników naszego testu z wynikami uzyskanymi inną metodą w laboratorium referencyjnym. Taką analizę przeprowadza się dla 30 próbek (dodatnich i ujemnych), sporządzając protokół walidacyjny, w którym określimy czułość i specyficzność testu, limit detekcji oraz spiszemy dokładnie instrukcję użycia testu i jego ograniczenia 11.

Testy molekularne manualne można znacząco przyspieszyć, korzystając z automatycznych urządzeń do izolacji RNA oraz stacji pipetujących, które zastępują żmudną pracę ludzką, ograniczają możliwość pomyłki i zmniejszają ryzyko kontaminacji, czyli zanieczyszczenia próbki.

SARS-CoV-2 a genom człowieka

Kolejnym aspektem genetycznym związanym z COVID-19, odchodząc już od genomu samego wirusa i jego diagnostyki, jest podatność na zachorowanie u pacjentów. Pomijając aspekty związane z układem immunologicznym i ogólnym stanem zdrowia, postaram skupić się na czynnikach zapisanych w naszych genach. Tu niestety pozostają głownie pytania bez odpowiedzi. Jak wspomniano wcześniej wnikanie wirusa SARS-CoV-2 zachodzi poprzez wiązanie z receptorami ACE2 obecnych na powierzchni ludzkich komórek. Istnieją wstępne badania wskazujące na różnice w ekspresji genu ACE2 pomiędzy różnymi populacjami, co może wskazywać na różne ryzyko zachorowania ze względu na pochodzenie etniczne 10. Kolejnym pytaniem jest, czy występują warianty sekwencji w samym genie ACE2 zmniejszające lub zwiększające ryzyko zachorowania na COVID-19. Być może istnieją jeszcze zupełnie inne geny, mogące modyfikować wnikanie wirusa do komórek organizmu czy też w inny sposób wpływające na przebieg choroby. Te i jeszcze inne pytanie wymagają badań z zakresu genomiki oraz przeanalizowania ogromnej liczby genomów osób chorych, a w szczególności tych odpornych na infekcję wirusem SARS-CoV-2. Jest to kluczowe zadanie dla nauki na najbliższe miesiące i lata, które może wpłynąć na opanowanie rozprzestrzeniania się epidemii np. poprzez izolację i dodatkową ochronę ludzi szczególnie podatnych na zachorowanie na COVID-19.

 

 

1. Kahn JS. History and recent advances in coronavirus discovery. Pediatr Infect Dis J 24, S223-7, discussion S226 (2005).

2. Zhu, N. et al. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

3. Benvenuto, D. et al. The 2019-new coronavirus epidemic: Evidence for virus evolution. J. Med. Virol. 92, 455–459 (2020).

4. Ceraolo & Gorgi. Genomic Variance of the 2019-nCoV Coronavirus. Journal of medical virology vol. 92 (2020).

5. Xu, H. et al. High expression of ACE2 receptor of 2019-nCoV on the epithelial cells of oral mucosa. Int J Oral Sci 12, 8 (2020).

6. Wang, C. et al. The establishment of reference sequence for SARS-CoV-2 and variation analysis. J. Med. Virol. (2020) doi:10.1002/jmv.25762.

7. Liu, S.-L., Saif, L. J., Weiss, S. R. & Su, L. No credible evidence supporting claims of the laboratory engineering of SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect 9, 505–507 (2020).

8. Hao, P., Zhong, W., Song, S., Fan, S. & Li, X. Is SARS-CoV-2 originated from laboratory? A rebuttal to the claim of formation via laboratory recombination. Emerg Microbes Infect 9, 545–547 (2020).

9. Andersen, K. G., Rambaut, A., Lipkin, W. I., Holmes, E. C. & Garry, R. F. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nature Medicine 1–3 (2020) doi:10.1038/s41591-020-0820-9.

10. Cao, Y. et al. Comparative genetic analysis of the novel coronavirus (2019-nCoV/SARS-CoV-2) receptor ACE2 in different populations. Cell Discov 6, 11 (2020).

11. Łaczmańscy Izabela i Łukasz, Walidacja metod molekularnych przeznaczonych do laboratoryjnej diagnostyki genetycznej. Journal of Laboratory Diagnostics 2009

Podziel się: