/

Sekwencjonowanie nowej generacji w diagnostyce medycznej

avatar
Dr Marzena Wojtaszewska 9 Sty, 4 minuty

Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing, NGS) szturmem wkroczyło we wszystkie dziedziny nauk biomedycznych. Obecnie jakiekolwiek badania podstawowe, dotyczące genetyki i biologii molekularnej trudno opublikować, jeśli nie wykorzystano w nich analiz NGS. Coraz więcej jest też praktycznych testów opartych na tej technologii, które są wykorzystywane w rutynowej diagnostyce klinicznej. Gdzie znalazła już ona, albo ma szansę znaleźć w najbliższym czasie, zastosowanie? Jakie są ograniczenia jej stosowania w praktyce klinicznej?

Ograniczenia i szanse NGS w diagnostyce klinicznej

Stosowanymi obecnie narzędziami w rutynowej laboratoryjnej genetyce medycznej są badania cytogenetyki klasycznej i molekularnej (GTG, FISH, aCGH) oraz cały wachlarz metod biologii molekularnej, bazujący na amplifikacji pojedynczych fragmentów DNA. Cały ten warsztat badawczy pozwala albo na mało szczegółową analizę rearanżacji chromosomowych albo szczegółową analizę pojedynczych mutacji/rearanżacji genowych w skali średnio kilkuset par zasad. Niestety większość chorób genetycznych może być spowodowana przez szereg mutacji punktowych rozrzuconych na przestrzeni tysięcy par zasad w sekwencji kodującej danego genu, a czynnikiem sprawczym niektórych są aberracje chromosomowe na tyle małe, że nie udaje się wykryć ich standardowymi technikami cytogenetycznymi. W onkologii mutacje chorobotwórcze lub predysponujące do zachorowania są rozproszone w wielu różnych obszarach genomu i maja bardzo różnorodny charakter. W mikrobiologii metody molekularne rzadko stosowane są w celach przesiewowych- zwykle są jedynie narzędziem pomocniczym z uwagi na możliwość wykrycia tylko kilku różnych patogenów w jednej reakcji.

To tylko niektóre wady tradycyjnych testów genetycznych, które nie pozwalają na tak szerokie ich zastosowanie, jakbyśmy sobie tego życzyli. Przezwyciężyć wiele z tych kwestii technicznych może technologia sekwencjonowania nowej generacji, która w zależności od zastosowania może zamienić się w wysokorozdzielcze narzędzie analizy cytogenetycznej, technikę molekularną wykrywającą kilka-kilkaset tysięcy wariantów naraz, czuły test przesiewowy na obecność konkretnych typów drobnoustrojów, czy też potężny panel badań, wykrywający jednocześnie wiele spośród onkogenów złego rokowania.

Problem z technologią głębokiego sekwencjonowania polega z jednej strony na konieczności zastosowania zupełnie nowego i kosztownego zaplecza aparaturowego (sekwenatory i ich urządzenia peryferyjne, niezwykle wydajny sprzęt komputerowy, software i ogromna przestrzeń dyskowa) a z drugiej strony wymaga zatrudnienia zupełnie nowego typu fachowców, wyszkolonych bioinformatyków i analityków genomowych, zajmujących się niełatwą analizą terabajtów danych. Zastosowanie NGS do diagnostyki in vitro musi także spełniać określone normy jakości, gwarantujące określone wartości graniczne parametrów analitycznych. Według danych amerykańskich do tej pory jedynie ok. 30 testów opartych o NGS posiada atest FDA, jednak laboratoriów w całych Stanach Zjednoczonych wykonujących testy molekularne jest już ponad 10 tysięcy, z czego większość wprowadziło jakąś formę NGS.

Do wyboru do koloru: czyli co potrafi kliniczny NGS?

Wbrew powszechnemu wyobrażeniu, NGS nie jest pojedynczym testem, ani nawet nie pojedynczą technologią. Mamy wiele platform sekwencjonujących i wiele pomysłów na ich wykorzystanie. Wśród sekwenatorów w laboratoriach przyklinicznych prym wiedzie aparatura firm Illumina (MiSeq,NestSeq,HighSeq) oraz Thermo (IonTorrent)- pracują one w technologii krótkich odczytów. Są one odpowiednie do detekcji wariantów patogennych w panelach genowych, określania ekspresji wybranych genów a także do sekwencjonowania egzomów a nawet genomów.

W zastosowaniach mikrobiologicznych swoją niszę odnalazł system długich odczytów Oxford Nanopore, który pozwala na sekwencjonowanie dłuższych fragmentów DNA lub RNA. Bez względu na wykorzystaną platformę, nowa generacja sekwenatorów daje nam możliwość detekcji małych zmian w DNA na poziomie pojedynczych genów (sekwencjonowanie amplikonowe) i w panelach genów – zastępując nam techniki PCR, sekwencjonowanie Sangera i MLPA. Co więcej, możemy sekwencjonować całe egzomy i genomy pacjentów, co pozwala nie tylko na wywołanie wariantów SNV, ale także na odtworzenie zmian strukturalnych. Do tej pory była to domena badań cytogenetycznych (klasyczne GTG), mikromacierzowych (aCGH) i techniki FISH. W onkologii dodatkowo zastosowanie znalazło już w rutynowej diagnostyce badanie RNAseq, czyli sekwencjonowanie transkryptów i transkryptomów. Zastępuje ono badania RT-PCR i RQ-PCR – oczywiście na o wiele większą skalę.

Przyszłość jest teraz

Na chwilę obecną są już dostępne liczne panelowe testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich liczba stale rośnie. Illumina, Archer, Roche, Qiagen, Thermo a także szereg mniejszych graczy co roku poszerza swoją ofertę gotowych testów ze znacznikiem „Dx”, przeznaczonych do wykrywania np. wariantów patogennych w mukowiscydozie, predyspozycji do wrodzonych nowotworów oraz do diagnostyki guzów litych i chorób rozrostowych układu krwiotwórczego. Chińska firma BGI (obecnie grupa MGI) specjalizuje się w produkcji testów przeznaczonych dla diagnostyki związanej z prokreacją – posiada w ofercie testy screeningowe na najczęstsze choroby genetyczne dla przyszłych rodziców czy też testy przesiewowe dla noworodków i niemowląt. Ich flagowym produktem jest zaś pierwszy na świecie powszechny test typu NIPT do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej, który można wykonać także w Polsce. Z kolei w diagnostyce mikrobiologicznej prym wiedzie Oxford Nanopore, który oferuje szybką i wygodną diagnostykę wielu patogenów w pojedynczym badaniu.

W chorobach rzadkich poza diagnostyką panelową dedykowaną dla konkretnych fenotypów chorobowych coraz częściej wykonywane są testy WES, czyli sekwencjonowanie całego egzomu, a także WGS, czyli sekwencjonowanie całego genomu (profilowanie całogenomowe).
Największy popyt i najdynamiczniejszy rozwój technik typu NGS ma miejsce oczywiście w onkologii. Całe programy lekowe opierają się obecnie na diagnostyce panelowej wariantów genetyczych obecnych w tkance guza, których wykrycie warunkuje włączenie pacjenta do programu lub jego bezwzględne z niego wykluczenie. Absolutnym hitem ostatnich dwóch lat okazała się technika profilowania całogenomowego WGS, dzięki której możemy nie tylko wywołać wszystkie patogenne warianty „driverowe”, ale także wykryć w genomie amplifikacje, rearanżacje (geny fuzyjne, delecje, duplikacje tandemowe itp) i fragmenty o utraconej heterozygotyczności, oraz określić, czy nowotwór będzie dobrym kantydatem do leczenia immunoterapeutykami lub inhibitorami PARP. Profilowanie całogenomowe jest obecnie wdrażane jako standard w Nowergii (np. Bergen Haukeland Hospital), Wielkiej Brytanii (ośrodki zrzeszone w konsorcjum Genomics England) oraz Stanach Zjednoczonych (MSK w Nowym Jorku).

I co dalej?

Podane przykłady nie wyczerpują długiej listy dostępnych obecnie zestawów diagnostycznych i technik NGS, a ich lista z dnia na dzień rośnie. Sekwencjonowanie nowej generacji zyskuje uznanie szczególnie w badaniach mikrobiologicznych (genotypowanie wirusów, m.in. HIV, analizach epidemiologicznych i diagnostyce drobnoustrojów z płynów ustrojowych pacjenta) oraz w badaniach rearanżacji chromosomowych, które były dotychczas domeną cytogenetyków. Na etapie walidacji są panelowe testy screeningowe dla wielu jednogenowych chorób rzadkich, związanych zarówno z genomem jądrowym, jak i mitochondrialnym. Na chwilę obecną poważnym ograniczeniem technologicznym jest stopień skomplikowania analizy bioinformatycznej i wymóg otrzymania odpowiedniej gwarantowanej ilości odczytów dla analizowanych amplikonów, co powoduje, że firmy produkujące zestawy diagnostyczne nie wykorzystują całkowicie potencjału tego narzędzia (np. ograniczając się do panelu kilkudziesięciu wariantów genowych, zamiast umożliwić wykrywanie kilkuset lub kilku tysięcy), jednak i tu każdy dzień przynosi nowy przełom. Jak grzyby po deszczu powstają nowe, coraz doskonalsze, oprogramowania do automatycznej analizy wyników sekwencjonowania z wygodnym interfejsem. Kolejne generacje sekwenatorów- oferujących dłuższe i dokładniejsze odczyty czekają na swoją premierę.

Prawdopodobnie nie ma takiego badania genetycznego, w którym nie znajdzie zastosowania głębokie sekwencjonowanie. Pytanie brzmi nie „czy”, ale „kiedy” technologia ta upowszechni się w każdej dziedzinie genetyki medycznej i we wszystkich rejonach świata. Nie ma wątpliwości, że niebawem będzie już standardem.

Źródła:

  1. Singh, R. R., Luthra, R., Routbort, M. J., Patel, K. P. & Medeiros, L. J. Implementation of next generation sequencing in clinical molecular diagnostic laboratories: advantages, challenges and potential. Expert Rev. Precis. Med. Drug Dev. 1, 109–120 (2016).
  2. Julka, P. K., Nayyar, H. K., Hussain, S., Mohindra, T. & Verma, A. Clinical utility of next-generation sequencing (NGS)-based genomic profiling of advanced solid tumors in routine clinical practice. J. Clin. Oncol. 36, e24157–e24157 (2018).
  3. Nucleic Acid Based Tests. FDA (2019) https://www.fda.gov/medical-devices/vitro-diagnostics/nucleic-acid-based-tests
  4. Luh, F. & Yen, Y. FDA guidance for next generation sequencing-based testing: balancing regulation and innovation in precision medicine. Npj Genomic Med. 3, 1–3 (2018).
  5. Genomics Core Facility (GCF). University of Bergen https://www.uib.no/en/clin2/genomics.
  6. The 100,000 Genomes Project | Genomics England. https://www.genomicsengland.co.uk/about-genomics-england/the-100000-genomes-project/.
  7. IGO Services. Memorial Sloan Kettering Cancer Center https://www.mskcc.org/research/ski/core-facilities/integrated-genomics-operation-igo/igo-services.
Podziel się: