Rok 2023 – co mamy obecnie do dyspozycji?

Rozwój biologii molekularnej doprowadził do powstania niezwykle czułych i specyficznych metod wykorzystywanych w diagnostyce szeregu chorób. Należą do nich między innymi reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR) wykorzystywana do badania ekspresji genów czy sekwencjonowanie genomu, w ramach którego wydziela się sekwencjonowanie pierwszej generacji – metodą Sangera, drugiej, tzw. sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next-generation sequencing, NGS) i trzeciej, do jakich zaliczamy technologie sekwencjonowania pojedynczej cząsteczki (ang. single molecule sequencing, SMS) oraz sekwencjonowanie nanoporowe. Do badania sekwencji genów również powszechnie wykorzystuje się mikromacierze molekularne, np. mikromacierze wykrywające jednonukleotydowe polimorfizmy (ang. single nucleotide polymorphisms, SNP). Mikromacierze (inaczej znane też jako macierze DNA, biochipy, czy chipy genowe) umożliwiają podczas jednego eksperymentu analizę ekspresji tysięcy genów na zasadzie hybrydyzacji (łączenia) specyficznych sond DNA (patrz przypis 1) o znanej sekwencji nukleotydowej rozpoznających tylko fragmenty poszczególnych transkryptów, odpowiadających danym genom.

Analiza SNP ma duże znaczenie w kontekście badania indywidualnych predyspozycji chorych do zapadalności na określone choroby genetyczne czy nowotwory. Jest również istotna w przypadku badania reakcji organizmu na podanie konkretnych leków. Metoda mikromacierzy SNP przeprowadzana jest na niewielkich płytkach, na których znajdują się tysiące sond zaprojektowanych specyficznie do badania tego typu zmienności, na podstawie wykrywania hybrydyzacji komplementarnych (przypis 2) do siebie cząsteczek DNA tzw. genotypowania [1]. Płytka z badanym materiałem genetycznym pacjenta wkładana jest do komory hybrydyzacyjnej i następnie następuje analiza emitowanego światła fluorescencji w czytniku laserowym. Obraz jest sczytywany przez odpowiednie oprogramowanie komputerowe w postaci kolorowych kropek odpowiadających każdej sondzie [2].

Co ciekawe, markery genetyczne, czyli specyficzne zmiany w sekwencji DNA danego genu są wymieniane w standardowych informacjach o lekach. Celem takiego zabiegu jest przewidywanie prawdopodobieństwa wystąpienia możliwych reakcji klinicznych oraz ich stopnia do oceny ryzyka podjętej farmakoterapii. Informacje te pozwalają również na ustalenie właściwego dawkowania leku oraz mogą służyć do oceny wrażliwości lub oporności pacjenta na lek. Wzmożone zainteresowanie tymi zagadnieniami zbiegło się w czasie wraz ze stworzeniem w 2004 roku przez firmę Roche Diagnostics® narzędzia, które miało być przełomowym w dziedzinie farmacji i medycyny, Amplichip CYP450.

Amplichip CYP 450 array to przenośne urządzenie diagnostyczne stworzone w celu poprawy bezpieczeństwa farmakoterapii, zatwierdzone przez Amerykańską Agencję Żywności i Leków (FDA, ang. Food and Drug Administration) oraz Europejską Agencję Leków (z ang. European Medicines Agency, EMA). Urządzenie jest oparte na metodzie mikromacierzy SNP, dzięki czemu możliwa jest identyfikacja różnic w obrębie dwóch genów kodujących cytochrom P450 — CYP2D6 (33 warianty) oraz CYP2C19 (3 warianty) [3,4]. Cytochrom P450 jest enzymem występującym powszechnie w niemal wszystkich tkankach człowieka, z największą aktywność w wątrobie oraz nadnerczach. Uczestniczy między innymi w syntezie cholesterolu, a także w jego dalszych przekształceniach w hormony steroidowe np. testosteron. W 2005 roku Amplichip CYP450 stał się komercyjnie dostępny.

W zależności od obecnych w DNA pacjenta poszczególnych wariantów genów, enzym charakteryzuje się różną zdolnością do metabolizowania substratów. Z punktu widzenia spersonalizowanej farmakoterapii narzędzie to otwiera ścieżkę do sprawdzenia genetycznych różnic w aktywności cytochromu P450 i powiązanych z nimi analogicznie różnic w metabolizmie leków Są to terapeutyki stosowane m.in. w onkologii, takich jak tamoksyfen (stosowany w leczeniu niektórych rodzajów raka piersi), czy w psychiatrii np. arypiprazol (stosowany w leczeniu schizofrenii  oraz choroby afektywnej dwubiegunowej) [5].

Rysunek 1. Przenośne urządzenie diagnostyczne AmpliChip® (Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ) źródło: https://doi.org/10.1007/978-1-4614-4800-6_39

Rok 2070 – przychodzi pacjent do lekarza rodzinnego

Ustalenie zdolności do metabolizowania ma duże znaczenie przy określaniu odpowiedniej dawki leku. W populacji ogólnej występują cztery grupy osób chrakteryzujące się odpowiednio:

• „ultraszybkim” metabolizmem (UM),
• „ekstensywnym”, czyli normalnym metabolizmem (EM),
• „pośrednim” metabolizmem (IM),
• „słabym” metabolizmem (PM)

leków zależnych od genów kodujących cytochrom P450 (CYP2D6 i CYP2C19).

Przykładem skuteczności działania AmpliChip może być badanie na grupie 4532 pacjentów leczonych psychiatrycznie, u których zmierzono za pomocą testu częstość występowanie omówionych typów metabolizmu leków. Ogólna częstość występowania osób słabo metabolizujących leki zależne od CYP2D6 (PM) wyniosła 7,6% (w tym 8,2% wśród osób rasy kaukaskiej, a 1,8% wśród Afroamerykanów), a ogólna częstość występowania osób z ultraszybkim metabolizmem (UM) wynosiła 1,5% ( w tym 1,5% u osób rasy kaukaskiej i 2,0% u Afroamerykanów). Z kolei ogólna częstość występowania osób słabo metabolizujących leki zależne od CYP2C19 wynosiła 2,0% (w tym 2,2% u osób rasy kaukaskiej i 4,0% u Afroamerykanów) [6].

Dostęp do takiej wiedzy może pomóc klinicystom w określeniu strategii leczenia pacjentów otrzymujących leki metabolizowane przez produkty genów CYP2D6 lub CYP2C19 np. leki przeciwdepresyjne, przeciwbólowe, przeciwnowotworowe, czy beta-blokery. Dodatkowo warto pamiętać, że zaburzenia funkcjonowania enzymów mogą nie tylko wpływać na obniżenie ich aktywności, ale także doprowadzać do kumulacji nieprzetworzonych substratów w organizmie i wywoływać niepożądane skutki uboczne farmakoterapii o różnym stopniu szkodliwości, czasem również z ciężkim zatruciem ze skutkiem śmiertelnym [3].

Rysunek 2. Możliwe strategie działania terapeutycznego 2023 vs 2070

Podsumowując

Już w 2006 roku naukowcy przewidzieli, że jest mało prawdopodobne, aby tak bardzo złożone podejścia farmakogenetyczne trafiły na rynek kliniczny w ciągu najbliższych pięciu do dziesięciu lat [7]. Jednakże mamy rok 2023 i minęły już prawie dwie dekady od tzw. „rewolucji genetycznej” i nadal tylko nieliczni słyszeli o wykorzystaniu testów molekularnych w celu ustalenia metabolizmu leków. Czy ta metoda jeszcze potencjał do zastosowania w przyszłości? Wprowadzenie spersonalizowanej medycyny rozwiązałoby wiele kwestii związanych z rozwojem przemysłu farmaceutycznego. Zmalałaby ilość efektów niepożądanych na podawany lek a także zmniejszyłyby się koszty badań klinicznych. Możliwe byłoby także wprowadzenie do sprzedaży dedykowanych testów diagnostycznych wraz z lekiem, tzw. towarzyszących testów diagnostycznych (CDx, ang. Companion diagnostics), które już znajdują szerokie zastosowanie w personalizowanym leczeniu pacjentów onkologicznych. Do takich testów należy między innymi panel NGS – FusionPlex®Dx (Invitae, ArcherDX) oraz inne podobne platformy, opierające się na unikalnych markerach nowotworowych, umożliwiając kompleksowe profilowanie genomowe u pacjentów ze złośliwymi guzami litymi [8].

Czy jeśli pójdziemy w 2070 roku do lekarza specjalisty, to czy przed wypisaniem recepty na dany lek otrzymamy również skierowanie na badanie mikromacierzy – na tak zwany „farmaceutyczny Bio-Chip”? A może przyjdziemy do lekarza rodzinnego już z całą sekwencją naszego genomu?  Tego dowiemy się już za niecałe 47 lat!

Przypisy:

1. Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next-generation sequencing, NGS) – nowoczesna wielkoskalowa metoda odczytywania kolejności nukleotydów w całym genomie lub wybranych regionach sekwencji DNA lub RNA przy użyciu odpowiedniej platformy i sekwenatora; „złoty standard” genomiki ze względu na wysoką wydajność i szybkość przy obniżeniu kosztów analizy
2. Sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki (ang. single molecule sequencing, SMS) – uproszczona innowacyjna metoda sekwencjonowania III generacji umożliwiająca odczyt sekwencji genetycznej z pojedynczej cząsteczki DNA lub RNA bezpośrednio z próbek biologicznych
3. Sekencjonowane nanoporowe – technika sekwencjonowania III generacji polegająca na przepływie kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) przez białkowe nanopory i identyfikacji ich na podstawie zmian w odczycie sygnału elektrycznego w czasie rzeczywistym
4. Sondy DNA – krótkie fragmenty DNA, specyficzne tylko dla danej mutacji lub polimorfizmu genetycznego.
5. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych np. DNA z DNA na zasadzie zgodności par zasad występujących w niciach kwasów nukleinowych; cytozyna (C) łączy się z guaniną (G), adenina (A) łączy się z tyminą (T).

Bibliografia:

1. LaFramboise T. Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances. Nucleic Acids Res. 2009;37(13):4181–93; DOI:10.1093/NAR/GKP552.

2. Bier FF, Von Nickisch-Rosenegk M, Ehrentreich-Förster E, Reiß E, Henkel J, Strehlow R, Andresen D. DNA microarrays. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2008;109:433–53; DOI:10.1007/10_2007_087.

3. Rebsamen MC, Desmeules J, Daali Y, Chiappe A, Diemand A, Rey C, Chabert J, Dayer P, Hochstrasser D, Rossier MF. The AmpliChip CYP450 test: cytochrome P450 2D6 genotype assessment and phenotype prediction. Pharmacogenomics J. 2009;9(1):34–41; DOI:10.1038/TPJ.2008.7.

4. López-Correa C, Gelbert LM. Clinical pharmacogenomics. Mol Genet Pathol Second Ed. 2013;9781461448006:1009–31; DOI:10.1007/978-1-4614-4800-6_39/TABLES/5.

5. Table of Pharmacogenomic Biomarkers in Drug Labeling | FDA n.d.;https://www.fda.gov/drugs/science-and-research-drugs/table-pharmacogenomic-biomarkers-drug-labeling (accessed January 14, 2023).

6. de Leon J, Susce MT, Johnson M, Hardin M, Maw L, Shao A, Allen ACP, Chiafari FA, Hillman G, Nikoloff DM. DNA microarray technology in the clinical environment: the AmpliChip CYP450 test for CYP2D6 and CYP2C19 genotyping. CNS Spectr. 2009;14(1):19–34; DOI:10.1017/S1092852900020022.

7. De Leon J, Susce MT, Murray-Carmichael E. The AmpliChip CYP450 genotyping test: Integrating a new clinical tool. Mol Diagn Ther. 2006;10(3):135–51; DOI:10.1007/BF03256453.

8. Invitae introduces two IVD test kits for cancer in Europe n.d.;https://www.medicaldevice-network.com/news/invitae-two-ivd-test-kits-cancer-europe/ (accessed February 5, 2023).

Fakty i Mity Genetyki tworzone są przez pasjonatów, specjalistów w swoich dziedzinach.
Ten artykuł czytasz za darmo, bez reklam, bez spamu. Doceń naszą pracę i postaw nam wirtualną kawę 🙂
Dziękujemy! – Wasza Redakcja FiMG