Prewencja kontaminacji: wyniki fałszywie dodatnie w PCR! Jak się przed nimi bronić?

avatar
Dr Marzena Wojtaszewska 25 Lut, 7 minut czytania

„Kontaminacja” to chyba najbardziej przerażający termin w słowniku każdego biologa molekularnego. Przypadkowe przeniesienie produktu PCR na blaty, plastiki lub sprzęt laboratoryjny może zamienić życie pracowników laboratorium w koszmar na długie tygodnie. Jak nie dopuścić do tej sytuacji? Przedstawiam Wam rozwiązania, które uchronią Was przed fałszywymi pozytywami i oszczędzą mnóstwa frustracji.

1. GLP przede wszystkim

Niestety nie istnieje rozwiązanie, które pozwoli nam zupełnie beztrosko poczynać sobie z produktami PCR w laboratorium. Podstawą każdej czynności, począwszy od pipetowania, skończywszy na usuwaniu odpadów, musi być dobra praktyka laboratoryjna i należy mieć tego pełną świadomość. Zacznijmy od najważniejszego: myślmy nad każdą wykonywaną czynnością. Niech nie zgubi nas rutyna!

*     Aby nie dopuścić do kontaminacji, spróbujmy rozdzielić przestrzennie czynności wykonywane w laboratorium. Przypiszmy pipety do poszczególnych stanowisk laboratoryjnych i nie wychodźmy z nimi poza obszar roboczy, do którego są przyporządkowane.

*     Pilnujmy tipsów- czy nakładane są do pudełek w innym miejscu niż wykonujemy PCR? Czy personel który to robi, używa zawsze świeżych rękawic? Czy pudełka na tipsy są zamykane, gdy z nimi nie pracujemy?

*     Uważajmy na standardy do Real-Time PCRu i próbówki z produktami reakcji. Kwestia warta rozważenia: jeżeli w każdym mikrolitrze standardu jest sto milionów kopii matrycy, to co się stanie, jeśli taki mikrolitr kapnie nam na stół a następnie zostanie roztarty przez sprzątaczkę ścierką po całym blacie? Albo gdy kapnie nam na rękę, którą następnie złapiemy za pipetę, klamkę lub mikropłytkę?

*     Zachowujmy szeroko rozumiany porządek wokół siebie

*     Dbajmy o reagenty: gdy to tylko możliwe, pipetujmy duże objętości na małe alikwoty do jednorazowego użytku. Zmieniajmy tipsy dodając po sobie kolejne reagenty. Nigdy nie przelewajmy resztek z jednej buteleczki do drugiej, bo możemy zepsuć kolejną partię odczynnika lub buforu!

 

2. Odpowiednie pomieszczenia laboratoryjne są na wagę złota

Jeżeli planujemy dopiero rozkład pomieszczeń laboratoryjnych, od początku miejmy na uwadze, że będziemy wykonywać w tych pomieszczeniach rożne etapy naszej pracy. Oddzielenie przestrzenne PCRu od reszty zadań laboratoryjnych jest najłatwiejszą i najskuteczniejszą bronią w walce z kontaminacją. Walczmy o każdą piędź ziemi z tymi, którzy finansują przedsięwzięcie, bo im więcej zainwestujemy w pomieszczenia, tym mniej stracimy na powtarzaniu nieudanych reakcji. To się zwróci- nie od razu, ale z cała pewnością. Szczytem luksusu, spotykanym na szczęście coraz częściej, jest posiadanie przemyślanego systemu filtrów HEPA, śluz i generatora nadciśnienia, które wywiewają aerozole poza przestrzeń czystą i pozwalają prawie wykluczyć ryzyko kontaminacji.

Jeżeli jednak nie dane nam są takie luksusy, spróbujmy w ramach posiadanych zasobów wydzielić odpowiednie strefy w swojej przestrzeni roboczej:

*     Strefa, w której będziemy trzymać nowe odczynniki, przygotowywać MIXy i bufory, DEPCować wodę, powinna być jak najbardziej oddalona od reszty pomieszczeń. Jest to pomieszczenie czyste.

W tym pomieszczeniu w małym laboratorium wykonywać również wstępną preparatykę materiału biologicznego oraz izolację DNA i RNA, ewentualnie katalogowanie i mrożenie analitów. W dużym laboratorium powinny być dedykowane do tego celu kolejne pomieszczenia- zależnie od rodzaju analiz- o statusie brudnym (naliza aerozoli, wirusologia) lub czystym (tkanki, hodowle komórkowe)

  Strefa “buforowa” to pomieszczenie/nia które mogą  oddzielać część brudną od czystej, może to być np. pomieszczenie biurowe/socjalne/sala komputerowa- miejsce na dokumentację, seminaria, pracę z komputerem itp. W nim w ogóle nie powinny znajdować się tu próbki ani reagenty.

*   Kolejne pomieszczenie czyste, to pomieszczenie gdzie przygotowujemy PCR i RT-PCR. Może to być mała “klitka” z mini-komorą laminarna jako jedynym sprzętem.

*   Pomieszczenie/nia, uważane za “brudne” w biologii molekularnej wcale nie oznaczają czystości mikrobiologicznej (patrz wyżej: czyste pod kątem produktów biologii molekularnej  mogą być pomieszczenia, gdzie dokonujemy preparatyki materiału biologicznego!). W strefie brudnej rozcieńczamy matryce, nastawiamy nested-PCR wykonujemy elektroforezę,  bloty i wykonujemy inne czynności post-PCR. Tam tez utylizujemy materiał.

Jest to najbardziej narażona na kontaminację cześć laboratorium- to tam otwieramy próbówki z namnożonym materiałem genetycznym. Idealny pokój tego typu jest całkowicie wyłożony kafelkami i powierzchniami zmywalnymi, odpornymi na silne utleniacze.  Zamiast komory laminarnej (radzę sobie ją całkowicie odpuścić o ile nie pracujemy z próbkami o wysokim zagrożeniu biologicznym lub z mikrośladami!) polecam właśnie kafelki. Zero półek, zakamarków, tylko stół, krzesło, 1 zestaw pipet i nic poza tym. Wszystko powinno dać się odkazić po zakończonym dniu pracy! (czym odkażać? O tym będzie traktować druga część opracowania!)

 

3. Mit lampy UV

W laboratoriach medycznych i badawczych złotym standardem jest dekontaminacja przy użyciu światła UV. Jest to bardzo dobre rozwiązanie, ale dla mikrobiologów i osób pracujących z hodowlami in vitro.

*     UV absolutnie nie nadaje się do pozbywania się DNA z powierzchni roboczych, jest na to zbyt mało wydajne!  Światło UV ma moc biobójczą, i mutagenną, ale nie lityczną w stosunku do polimerów DNA. Poza tym jego działanie jest ograniczone do przestrzeni nieporowatych, wystawionych bezpośrednio na promieniowanie.

*     UV zażółca papier i niszczy niektóre tworzywa sztuczne, więc nie powinniśmy trzymać tam dokumentacji. Musimy także chronić np. klawiatury komputerowe.

*     Jeszcze jedna ważna rzecz, o której się nie pamięta. Światło UVC  jest potężne, ale świetlówki szybko się zużywają. Po roku tracą nawet połowę swojej emisji UVC – taka świetlówka już nie nadaje się do dekontaminacji.

Komu więc polecać UV?

Pracowniom, które pracują z ludzkimi płynami ustrojowymi do pomieszczeń, w których wykonuje się np. ekstrakcję białek czy kwasów nukleinowych i gdzie utylizuje się materiał aktywny biologicznie. Obowiązkowo do pracowni mikrobiologii i tam, gdzie prowadzi się hodowle komórkowe. UV nie radzi sobie z wirusami tak wydajnie jak z bakteriami, ale i tak pomaga w walce np. z fagami. Natomiast UV w pomieszczeniach do PCR i pod komorami laminarnymi sprawdza się raczej słabo. Można je stosować jako dodatkowy środek ochronny- wszak nie zaszkodzi, ale pożytku z niego niewiele.

 

Na kłopoty… wybielacz

W pierwszej części tego dwuodcinkowego cyklu wspominałam, że pomieszczenie w którym pracować będziemy z produktami PCR powinno być odporne na utleniacze. Co konkretnie miałam na myśli? Żeby pozbyć się DNA najprościej jest je chemicznie unieszkodliwić. Są na to dziesiątki sposobów, a jak zwykle najlepsze są te najtańsze i znane z naszych gospodarstw domowych.

*     W literaturze spotykamy różne pomysły na dekontaminację, prym wiedzie HCl i mieszaniny kwasu z rozmaitymi substancjami (np.glicyną, detergentami) wspomagającymi. HCl 1M obniża pH do tego stopnia, że indukuje depurynację i hydrolizę DNA.  Gorący kwas solny z glicyną jest szczególnie polecany do dekontaminacji końcówek pipet, jednak mycie nim większych powierzchni jest niewskazane. Kwaśna hydroliza wymaga albo podwyższonej temperatury, albo długiego czasu ekspozycji. Dlatego nie jest polecana do ogólnych zastosowań.

*     DNA ulega hydrolizie także pod wpływem środków do sterylizacji i dezynfekcji wysokiego stopnia, takich jak tlenek etylenu i gazowy formaldehyd oraz aldehyd glutarowy. Jednakże tych związków każdy z nas chciałby unikać jak ognia. Są to środki bardzo korozyjne i niebezpieczne dla błon śluzowych, używane w celu całkowitej eliminacji patogenów np. z materiałów i narzędzi chirurgicznych. Nie wiem, czy gdziekolwiek poza niektórymi laboratoriami w standardzie BSL3/4 stosuje się rutynowo te środki.

*     Skuteczne w walce z kontaminacją DNA są także… dostępne w zwykłych marketach wybielacze i środki czyszczące.  Odpowiednio rozcieńczony roztwór NaOCl tworzy nacięcia nici (nick’uje DNA) i tym samym uniemożliwia amplifikację. Podobnie działa wiele innych specyfików dostępnych w sklepach z chemią gospodarczą. Tabletki np. “calgonitu”, zawierające wodorotlenki sodu i potasu oraz podchloryn, wszelkie środki w sprayu wydzielające wolny chlor lub tlen rodnikowy (oparte na eterach, epoksydach, aldehydach) są jak najbardziej skuteczne i bardziej bezpieczne dla użytkownika niż środki do sterylizacji gazowej.

*     Dostępne w katalogach niektórych firm produkujących odczynniki są specjalne, przeznaczone do dekontaminacji preparaty typu „DNA-Away”. Mogą to być roztwory DNAz lub środki chemiczne. Są droższe niż metody chałupnicze, ale dużo łatwiejsze w użyciu i mniej drażniące dla śluzówek. Osobiście używałam środka pachnącego palonym karmelem, który był niesamowicie skuteczny. Warto przetestować i policzyć zyski i ryzyka, bo może się okazać że warto w nie zainwestować.

Jak używać wybielacza?

Ważne jest stężenie aktywnego chloru. DNA-bójczo działa nawet 0,5% roztwór, wystarczy więc odpowiednio rozcieńczyć wybielacz i przemyć blaty. Albo zastosować spryskiwacz. Ważne jest, by pozostawić warstwę wybielacza na mytej powierzchni przez 15minut albo do wyschnięcia, a potem zmyć wodą. Najlepsze działanie związków generujących rodniki tlenowe i wolny chlor otrzymujemy przy kontakcie preparatu z powietrzem, dlatego nanosimy cienką warstewkę, nie urządzamy kąpieli np. statywów w wybielaczu, raczej je spryskujemy.

 

Tipsy z filtrem- koszt który warto ponosić

W połączeniu z regularnym myciem powierzchni wybielaczami i okresowymi kąpielami końcówek pipet w HCL-glicynie, dobrze jest stosować tipsy z filtrem jako prewencję w codziennej praktyce laboratoryjnej. Tipsy z odpowiednio umiejscowionymi, grubymi filtrami pozwalają na ochronę pojedynczych próbek przed aerozolami DNA, które mogą osadzić się na dispenserze podczas pipetowania. Taka ochrona jest szczególnie polecana w laboratoriach diagnostycznych i w placówkach korzystający z metod Q-PCR i nested-PCR.

Warto zwrócić uwagę na jakość filtra. Spotkałam się z produktami, w których silikonowa wkładka nie powinna w ogóle zostać uznana za filtr, gdyż jej niewielka grubość nie zapewniała żadnej ochrony. Na rynku dostępne są końcówki zawierające nawet 2 lub 3 warstwy filtrujące- takiemu rozwiązaniu nie oprze się żaden aerozol DNA. Nie polecam oszczędzać na końcówkach z filtrem, jeżeli w naszym laboratorium zdarzały się w przeszłości zanieczyszczenia oraz w sytuacji, gdy nie dysponujemy pomieszczeniami dedykowanymi do PCRu i komorami laminarnymi. Oszczędność 10zł na opakowaniu tipsów może nas kosztować setki złotych stracone na powtarzaniu reakcji PCR!

 

UNG: rozwiązanie wygodne, ale nie zawsze praktyczne

Uracylo-N-glikozylacja to elegancka metoda unieszkodliwiania kwasów nukleinowych po reakcji PCR. Używana jest już od wielu lat i pozwala na większą swobodę pracy z produktami PCR.

*     UNG to system amplifikacji opartej na deoksyurydynie zamiast deoksytymidyny. Po reakcji PCR otrzymujemy produkt z inkorporowaną dU, która (o ile zostanie przeniesiona do kolejnej reakcji) jest niszczona przez specjalny, dodawany do reakcji enzym urydylo-N-glikozylazę przed rozpoczęciem właściwej amplifikacji PCR. Tym sposobem nici zawierające dU degradują i nie mogą stanowić matrycy w reakcji która uległa kontaminacji.

*     Warto zasygnalizować, że UNG pozwala na uniknięcie kontaminacji tylko matrycami z inkorporowanym dU z poprzednich reakcji PCR, nie daje natomiast żadnej ochrony przed kontaminacją na pierwszych etapach pracy z analitem. Tak więc wracamy do punktu wyjścia, czyli opisanego w I części tego opracowania GLP.

*     Drugim ważnym mankamentem jest bezzasadność wykorzystania UNG w reakcjach nested-PCR, w których konieczne jest reamplifikowanie matrycy z poprzedniego PCRu. Można do drugiego MIXu nie dodawać UNG, ale w ten sposób znowu możemy paść ofiarą kontaminacji! (Szczególnie wówczas, gdy przyzwyczaimy się do dobrego, czyli pracujemy mniej skrupulatnie gdyż chroni nas UNG)…

 

Tak oto wspólnie dotarliśmy do końca opracowania, które może ułatwi Wam pracę w czystym, wolnym od kontaminacji otoczeniu. Czego Wam i sobie życzę!

Obraz zawierający wewnątrz, kubek, stół, siedzi Opis wygenerowany automatycznie

 

Wybielacz
nie powinno go zabraknąć w łazience i w … laboratorium!

[By MarkGallagher 14:56, 31 October 2005 (UTC) – Taken by Yours Truly., CC BY-SA 2.5, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=395979]

 

Tekst ten oryginalnie powstał dla portalu Dolina Biotechnologiczna. Dzięki uprzejmości dr Zazuli możliwe było jego odświeżenie i ponowne opublikowanie przez Autorkę dla portalu “Genetyka”.

Podziel się: