/

Nowy poziom
regulacji ekspresji genów:
interferencja RNA

avatar
Marta Andrzejewska 30 Gru, 8 minut czytania

 

Każda komórka w naszym ciele ma taki sam zestaw informacji genetycznej, czyli genom. Składają się na niego geny, stanowiące jedynie mały ułamek całości – większa część to informacja, która nie zostanie przepisana na białko (tzw. sekwencje niekodujące). Mimo to, jedne z naszych komórek są neuronami, inne komórkami mięśniowymi, jeszcze inne komórkami przewodu pokarmowego wyspecjalizowanymi do efektywnego wchłaniania substancji z pokarmu.

Taka postać rzeczy możliwa jest dzięki istnieniu procesu zwanego specjalizacją komórek. Odbywa się on na bazie regulacji ekspresji genów i polega na wyciszaniu genów niepotrzebnych w danym momencie oraz aktywowaniu tych, których białkowe produkty są niezbędne do funkcjonowania danej komórki. Jeszcze kilkanaście lat temu znane były nam jedynie podstawowe procesy i struktury wpływające na ekspresję genów, takie jak:

  • obecność sekwencji regulatorowych genu, czyli fragmentów DNA, które są przewodnikami mediującymi proces transkrypcji (przypis 1), sprawiając, że albo jest ona aktywowana albo blokowana,
  • białka wiążące DNA – szczegółowo określone białka, które wiążąc się z DNA są w stanie pobudzać transkrypcję (czynniki transkrypcyjne),
  • modyfikacje epigenetyczne, z których najważniejsze i najlepiej poznane to:
  • metylacja – proces, podczas którego do pewnych części DNA przyłączane są grupy metylowe, co zmienia aktywność danego fragmentu nici DNA i czyni go niedostępnym dla maszynerii transkrypcyjnej,
  • acetylacja, polegająca na przyłączeniu grupy acetylowej do specyficznego “wystajacego ogonka” DNA, które nawinięte jest na histon (przypis 2). Proces ten zmniejsza powinowactwo histonów do DNA, rozluźniając strukturę chromatyny (przypis 3),

ale można do nich zaliczyć także: ubikwitynację, fosforylację i sumoilację. Dzięki wszystkim tym procesom regulowana jest struktura chromatyny.

Jednak w 1998 roku badania prowadzone przez Andrew Fire’a i Craiga Mello, amerykańskich naukowców, na pewnym nicieniu (C. elegans) rzuciły nowe światło na proces ekspresji genów.

Naukowcy w swoim eksperymencie zaprojektowali dwuniciowe RNA (dsRNA, ang. double-stranded RNA) nicieniowego genu unc-22, składające się z komplementarnych nici: sensownej i antysensownej (przypisy 4 i 5) i przeprowadzili jego transfer do embrionów badanego nicienia. Wcześniejsze badania, które skupiały się na dostarczaniu tylko jednej części RNA – nici sensownej lub antysensownej, nie dawały żadnych zauważalnych efektów. Dopiero dsRNA zaprogramowane tak, by posiadało sekwencję komplementarną (przypis 6) do mRNA genu, który objęli za swój cel, zadziałało, modulując jego ekspresję. Mogło to być zauważone, ponieważ już dorosły osobnik C. elegans zaczął… drgać.

Nie bez powodu wybrano gen unc-22 – naukowcy wiedzieli, że jest to gen odpowiedzialny za produkcję jednego z białek wchodzących w skład miofilamentu, czyli “nitek”, z których składają się mięśnie i które budują podstawowe ich jednostki odpowiedzialne za skurcz. Uszkodzenie genu unc-22 skutkuje brakiem produkcji lub produkcją uszkodzonego białka. W efekcie mięśnie nicienia nie są w stanie rozwinąć lub utrzymać normalnych skurczów, ale małe regiony w obrębie poszczególnych komórek mięśniowych kurczą się czasami i nieregularnie. Wywołuje to końcowo ruchy drgawkowe.

 

Rysunek 1: Rysunek przedstawia efekt fenotypowy po wstrzyknięciu do gonad C. elegans odpowiednio: jednoniciowego RNA – nici sensownej oraz antysensownej i dsRNA. Wszystkie cząsteczki RNA dla genu unc-22. Dopiero wstrzyknięcie dsRNA powoduje powstanie potomstwa C. elegans wykazującego fenotyp drgawkowy (ang. twitcher).

[Źródło: https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2006/advanced-information/]

 

Naukowcy przeprowadzili także bardziej szczegółowe badania, które miały wyjaśnić mechanizm, w jakim dsRNA zadziałał w taki, a nie inny sposób. Okazało się, że mRNA, które było “celem” zaprojektowanego dsRNA nie było już obecne, zatem musiało w pewien sposób zostać zdegradowane. Mimo tego, że nie użyli wielu cząsteczek dsRNA, ich ilość była wystarczająca dla osiągnięcia zauważalnego efektu. Wysunięto zatem hipotezę, że istnieje możliwość ich amplifikacji (przypis 7) lub działają jak enzymy, tzn. nie są zużywane w czasie trwania reakcji.

Fire i Mello zasugerowali w swojej publikacji na łamach Nature, że doświadczenie, które przeprowadzili wskazuje na istnienie procesu wyciszania genów i że może to być proces fizjologiczny. Nazwali go interferencją RNA (RNAi) [1, 2].

 

Jak dokładnie działa RNAi?

Interferencja RNA to proces posttranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów. Jest on niejako rozszerzeniem tego, jak owa ekspresja genów była postrzegana do czasu udowodnienia istnienia RNAi – że ekspresja zachodzi przed/w trakcie transkrypcji. Tutaj mamy do czynienia już z gotowym mRNA, które mogłoby być przepisane na białko w procesie translacji, jednak tak się właśnie nie dzieje.

W komórce tworzy się dsRNA, które następnie cięte jest przez enzymatyczne białko Dicer. W ten sposób tworzą się krótkie jego fragmenty, nazywane od tej pory siRNA (ang. small interfering RNA) – małe interferujące RNA. Mają one zazwyczaj jedynie 21-25 par zasad. Tak gotowe małe cząsteczki RNA łączą się następnie z kompleksem białkowym zwanym RISC, czyli indukowanym przez RNA kompleksem wyciszającym (ang. RNA-induced silencing complex). Razem podróżują do docelowego mRNA, którego produkt ma zostać wyciszony. Jeden ze składników RISC, czyli białko AGO2 (białko Argonauta), staje się wtedy niejako molekularnymi nożyczkami i tnie mRNA w konkretnym miejscu tak, by zapobiec późniejszej translacji i powstaniu białka. Niepotrzebne – bo niefunkcjonalne! – mRNA jest degradowane w komórce.

Jak się okazuje, nie tylko siRNA może brać udział w procesie RNAi – na podobnej zasadzie działa również miRNA (przypis 8).

Rysunek 2: Mechanizm działania RNAi – opisany w tekście. [Rysunek własny]

 

Nowa era terapii genowych

Mechanizm RNAi może wydawać się dziwny i trudny. Warto go jednak znać – jego znaczenie jest naprawdę duże, bowiem został on z powodzeniem wykorzystany w opracowywaniu nowych leków. Ich zaletą jest przede wszystkim ścisła specyficzność. Mechanizm RNAi pozwala na leczenie chorób genetycznych dziedziczonych autosomalnie dominująco (przypis 9). Do pewnego czasu nie było to możliwe, a większość terapii genowych skupiała się na leczeniu chorób dziedziczonych autosomalnie recesywnie (przypis 10) poprzez np. dostarczenie oligonukleotydów antysensownych (przypis 11) czy wprowadzania wektora wirusowego zawierającego gen dla brakującego enzymu lub po prostu gen, który jest uszkodzony w danej chorobie.

Obecnie, dzięki RNAi, do dyspozycji mamy kilka leków. Są to:

Patisyran (Onpattro) – lek przeznaczony do stosowania w leczeniu dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej (hATTR, ang. hereditary transthyretin-mediated amyloidosis) u dorosłych pacjentów z polineuropatią w I lub II stadium zaawansowania. Lek ten jest w istocie nanocząsteczkami lipidowymi zawierającymi siRNA, które dostarczane jest do komórek wątroby. To właśnie te komórki są głównym źródłem transtyretyny, czyli prekursora amyloidu. Patisyran doprowadza do degradacji mRNA transtyretyny, zatem jej stężenie w surowicy krwi się zmniejsza, co końcowo doprowadza do zmniejszenia stopnia polineuropatii u pacjentów z hATTR [3].

Inklisiran (Leqvio) – lek ten jest wskazany u osób dorosłych cierpiących na pierwotną hipercholesterolemię (heterozygotyczną hipercholesterolemię rodzinną i hipercholesterolemię wielogenową) lub dyslipidemię mieszaną. Można go stosować w przypadku, gdy przeciwwskazane jest stosowanie klasycznych leków obniżających poziom cholesterolu we krwi (statyny) lub wykorzystano wszystkie dostępne możliwości terapeutyczne i nie przyniosły one skutku (statyny w maksymalnej dawce połączone z innymi lekami zmniejszającymi stężenia lipidów). Substancja ta również docelowo działa w hepatocytach, gdzie ma za zadanie – w skrócie – zwiększyć recykling i ekspresję receptorów dla cholesterolu LDL na powierzchni komórek wątroby, dzięki czemu nasila się wychwytywanie najbardziej niebezpiecznych cząstek cholesterolu (LDL) i zmniejsza się jego stężenie w układzie krążenia [4].

Giwosyran (Givlaari) z kolei, to środek przeznaczony do leczenia ostrej porfirii wątrobowej (AHP, ang. acute hepatic porphyria). Działa oczywiście w mechanizmie RNAi, doprowadzając do degradacji mRNA enzymu syntazy kwasu aminolewulinowego typu 1 (ALAS1, ang. aminolevulinic acid synthase 1), dzięki czemu jego poziom normalizuje się. Mniej enzymu to mniej wydajne reakcje, a co za tym idzie – mniej produktów pośrednich tychże reakcji (np. kwas aminolewulinowy, porfobilinogen), które niestety są toksyczne i są kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do napadów i objawów ostrej porfirii wątrobowej [5].

Lumazyran (Oxlumo) to lek, który został zaprojektowany do stosowania w leczeniu pierwotnej hiperoksalurii typu 1 (ang. primary hyperoxaluria type 1, PH1). Dzięki niemu obniżany jest poziom oksydazy glikolanowej (ang. glycolate oxidase, GO). Dzięki temu obniża się poziom glioksalanu – substratu w reakcji powstawania toksycznych szczawianów. Ich stężenie obniża się w moczu i w osoczu krwi. Szczawiany przede wszystkim są toksyczne dla nerek. Mają potencjał tworzenia kryształów, a co za tym idzie – kamicy nerkowej oraz, w najgorszych przypadkach, wapnicy nerek (nefrokalcynozy) [6].

Wymienione wyżej cztery leki to tylko początek używania mechanizmu RNAi w produkcji leków. W trzeciej fazie badań klinicznych są takie leki jak: Fitusiran, przeznaczony dla pacjentów z hemofilią A i B, Cosdosiran dla pacjentów cierpiących na przednią ischemiczną neuropatię nerwu wzrokowego, czy Teprasiran, który ma być używany w przypadku ostrej niewydolności nerek [7]. Sirany – bo tak często nazywana jest ta podgrupa leków – to przede wszystkim środki bezpieczne, w przypadku których nie wykazano ciężkiej toksyczności. Nie wymagają także codziennego podawania – ich efekt jest stosunkowo długi – co zdecydowanie ułatwia ich stosowanie [8, 9]. W zależności od leku, częstość podawania jest różna – Lumazyran np. powinien być podawany co 3 miesiące (po podaniu wstępnych dawek nasycających), a Patisyran co 3 tygodnie [3, 6]. Zdecydowanie jest to bardziej komfortowe niż codzienne przyjmowanie.

Zjawisko interferencji RNA zostało docenione dopiero po kilku latach od jego odkrycia. W 2002 roku RNAi zostało nazwane przełomem roku i nagłośnione przez magazyn naukowy Science [10]. W 2004 roku na łamach Plos One pojawiła się publikacja “Leki RNAi: jak prawdopodobne, jak szybko?” (RNAi Therapeutics: How Likely, How Soon?) [11]. W 2006 roku przyszedł Nobel [1] i od tego czasu wiadomo, że mimo swojego skomplikowania, RNAi to naprawdę mechanizm, którego znajomość otworzyła nowe możliwości w genetyce.

 


Fakty i Mity Genetyki tworzone są przez pasjonatów, specjalistów, naukowców i lekarzy. Ten artykuł czytasz za darmo, bez reklam, bez spamu. Doceń naszą pracę i postaw nam wirtualną kawę 🙂 Dziękujemy! – Wasza Redakcja FiMG

Postaw mi kawę na buycoffee.to


 

Przypisy:

  1. Transkrypcja – proces przepisania informacji zawartej w DNA na RNA. RNA wzorowane jest na DNA, a w procesie bierze udział szereg enzymów katalizujących niezbędne reakcje – polimeraz.
  2. Histon to białko przypominające swoją rolą szpulkę do nici – na histony “nawija się” DNA, dzięki czemu istnieje gwarancja, że się ono nie zaplącze i nie zostanie uszkodzone podczas procesów komórkowych. Histony mają także bardzo ważną funkcję w umożliwianiu modyfikacji epigenetycznych, bowiem z każdej “szpulki” wystaje “ogonek nici”, który może być modyfikowany.
  3. Chromatyna to nazwa struktury, jaką tworzy nić DNA i białka jej towarzyszące (np. histony). Można ją przyrównać do łańcuszka z koralikami. Jest ona zwyczajowo luźna, a po zwinięciu (skondensowaniu) tworzy chromosom.
  4. Nić sensowna (=nić kodująca) – jedna z dwóch przeciwrównoległych nici DNA. Nić ta nie bierze bezpośredniego udziału w procesie transkrypcji.
  5. Nić antysensowna (=nić matrycowa) – jedna z dwóch przeciwrównoległych nici DNA. Nić ta bierze udział w procesie transkrypcji, a jej sekwencja nukleotydów jest komplementarna do produktu transkrypcji – mRNA oraz do nici sensownej.
  6. Sekwencja komplementarna – sekwencja, która podlega regule komplementarności. W genetyce jest to pojęcie określające, która z zasad azotowych może stworzyć parę z inną zasadą azotową, dzięki czemu utrzymywane jest np. dwuniciowe DNA.
  7. Amplifikacja w biologii to nazwa procesu, podczas którego dochodzi do zwiększenia ilości lub liczby danej cząsteczki
  8. miRNA – mała, zazwyczaj mająca około 21-23 nukleotydy, cząsteczka RNA, która reguluje ekspresję innych genów. Obecnie jest wykorzystywana jako marker wielu chorób. Bierze również udział w RNAi.
  9. Dziedziczenie autosomalnie dominujące to sposób dziedziczenia, w którym konkretna cecha dziedziczy się w sprzężeniu z chromosomami autosomalnymi, tj. innymi niż chromosomy płci i ma zdolność ujawnienia się zarówno w układzie heterozygotycznym (dwa inne allele danej cechy) jak i homozygotycznym (dwa takie same allele dla danej cechy).
  10. Dziedziczenie autosomalnie recesywne to sposób dziedziczenia, w którym konkretna cecha dziedziczy się w sprzężeniu z chromosomami autosomalnymi, tj. innymi niż chromosomy płci i nie ma zdolności do ujawnienia się w układzie heterozygotycznym. Konieczny jest układ homozygotyczny – posiadanie dwóch zmutowanych alleli dla danej cechy.
  11. Oligonukleotydy antysensowne – specjalnie zbudowane połączenia 20-30 nukleotydów, które mają zdolność oddziaływania z mRNA i genomowym DNA. Mogą one modulować ekspresję genów. Są to cząsteczki oddziałujące z mRNA i fragmentami genomowego DNA. Wykorzystywane są do hamowania ekspresji genów. Ich sekwencja jest komplementarna do sekwencji DNA genu, który mają za cel.

Bibliografia:

[1] The 2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine – Advanced information – NobelPrize.org

[2] Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans

[3] Onpattro, INN-patisiran

[4] Leqvio, INN-inclisiran

[5] Givlaari, INN-givosiran

[6] OXLUMO, INN-lumasiran

[7] The growth of siRNA-based therapeutics: Updated clinical studies

[8] Breakthrough for systemic RNAi

[9] https://news.mit.edu/2002/rnia

[10] RNAi Therapeutics: How Likely, How Soon?

 


Fakty i Mity Genetyki tworzone są przez pasjonatów, specjalistów, naukowców i lekarzy. Ten artykuł czytasz za darmo, bez reklam, bez spamu. Doceń naszą pracę i postaw nam wirtualną kawę 🙂 Dziękujemy! – Wasza Redakcja FiMG

Postaw mi kawę na buycoffee.to


Obrazek tytułowy pochodzi z serwisu Freepik.

Podziel się: