Niesamowity CRISPR/Cas9 i jego zastosowania

avatar
mgr Agata Jóźwiak 30 Paź, 9 minut czytania

 

Tegoroczną Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii otrzymały Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna za opracowanie niezwykle precyzyjnej i wydajnej technologii edycji genomu, jaką jest CRISPR/Cas9. To potężne narzędzie inżynierii genetycznej daje nam nadzwyczajne możliwości. Przykłady zastosowań mogą nas zaskoczyć. Ważniejsza jednak wydaje się kwestia, czy tak silne narzędzie jest i będzie odpowiednio wykorzystywane.

  • Rewolucja, która już trwa

Wykonywanie manipulacji genetycznych jeszcze nigdy nie było tak łatwe. Dzięki systemowi CRISPR/Cas9 edycja genów stała się efektywniejsza, tańsza oraz szybsza. Obecnie możliwe jest wprowadzanie nowych genów czy też inaktywowanie już istniejących. Ale to nie wszystko! Możliwe jest także włączanie i wyłączanie genów w zaplanowanym przez nas czasie, w tkankach czy komórkach przez nas wybranych. Przynajmniej w teorii, bo praktyka okazuje się być często nieco trudniejsza. O niemalże nieskończonych możliwościach technologii CRISPR/Cas9 połączonej z innymi narzędziami inżynierii genetycznej można by wiele mówić (podstawy techniki opisałam w poprzednim artykule – LINK). Skupmy się jednak w tym miejscu na paru przykładowych zastosowaniach.

  • Edycja genów w komórkach

Wiele grup badawczych prowadzi eksperymenty na liniach komórkowych (a jest tu w czym wybierać!), które można przenieść na wyższy poziom, wyłączając w nich wybrane geny lub po prostu edytując ich DNA. Technologia CRISPR pozwala na generację takich zmodyfikowanych linii komórkowych w zaledwie parę miesięcy. To właśnie dzięki niej edycja genomu stała się bardziej przystępna.

Jeśli nie jesteśmy pewni, jaką funkcję pełni dane białko w komórce, możemy po prostu wyłączyć gen, który je koduje i obserwować zachodzące w niej zmiany! Projektowanie podobnego eksperymentu nie jest czymś łatwym, ale liczne narzędzia stworzone przez bioinformatyków znacznie to ułatwiają. Przykładem może być choćby Benchling CRISPR Tool lub CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/). Wystarczy wybrać odpowiedni gen, a jego sekwencja nukleotydowa załaduje się automatycznie. Ale to dopiero początek… ten software zaproponuje nam gotowe sekwencje nukleotydowe, które możemy wykorzystać w naszym eksperymencie do edycji DNA.

Potężne narzędzie inżynierii genetycznej, jakim jest CRISPR wykorzystuje się także do odkrywania nowych celów dla terapii przeciwnowotworowych [1]. Badając geny i kodowane przez nie białka, poznajemy potencjalne cele molekularne, które możemy wykorzystać w walce z nowotworem. CRISPR wykorzystuje się do generowania modeli komórkowych, które pomagają uchwycić skomplikowany krajobraz mutacji w ludzkich guzach, ich różnorodność genetyczną. Eksponując takie zmodyfikowane komórki na jeden lub kilka leków, a następnie badając, które z nich przeżyły, możemy wyciągać wnioski na temat kluczowych genów, które decydują o odpowiedzi nowotworu na leczenie. Wiedza ta jest potrzebna do rozwoju terapii celowanych, które niosą ogromną nadzieję dla chorych. Termin „terapia celowana” (ang. targeted therapy) odnosi się do generacji leków przeciwnowotworowych zaprojektowanych, aby zakłócać działanie specyficznego celu molekularnego (inaczej mówiąc, produktu genu), który odgrywa kluczową rolę we wzroście i progresji konkretnego nowotworu. Taka terapia jest skuteczna tylko u danej grupy pacjentów, których nowotwór można sklasyfikować na podstawie obecności konkretnej zmiany genetycznej. Dlatego to właśnie nasze DNA ma kluczowe znaczenie w doborze personalizowanej terapii, a informacja genetyczna zawarta w nowotworze może powiedzieć nam, czym możemy go pokonać, a na co będzie on odporny [2,3].

 

  • Nie zapominajmy o zwierzętach

Edycja materiału genetycznego wykorzystywana jest także do tworzenia tzw. zwierząt transgenicznych. Zwierzęta transgeniczne to takie, których każda komórka zawiera jakąś nową informację genetyczną, która będzie przekazana kolejnym pokoleniom. I w tej dziedzinie CRISPR odnalazł się doskonale. Stosowanie CRISPR wraz z innymi narzędziami inżynierii genetycznej sprawiło, że czas potrzebny na stworzenie zwierząt transgenicznych uległ skróceniu. Stało się to też bardziej efektywne, łatwiejsze oraz tańsze. Jedną z większych zalet tej technologii jest to, że modyfikacje genetyczne są dokonywane w sposób bardzo precyzyjny. Edycja genów stała się więc o wiele dokładniejsza. Ale wróćmy na chwilę do samych zwierząt transgenicznych… W czym one mogą nam pomóc? Co mogą dla nas zrobić? Otóż okazuje się, że bardzo dużo.

Zwierzęta transgeniczne, które produkują mleko, są wyjątkowo pożyteczne, jeśli chodzi o produkcję białek, wykorzystywanych np. w celach terapeutycznych. Dzięki edycji genów możemy sprawić, aby mleko takich zwierząt (między innymi krów, kóz, królików) wzbogacone było dodatkowo o takie białko, jakie jest nam potrzebne. Może to być na przykład: insulina, hormony wzrostu, czynniki zapobiegające krzepliwości krwi, rozmaite przeciwciała. Wszystkie mogą być stosowane potem podczas różnych terapii.

Wielu z nas nie zdaje sobie także sprawy z tego, jak duży wpływ na stan naszej wiedzy o chorobach, tych powszechnych i tych rzadkich, mają eksperymenty przeprowadzane właśnie na zwierzętach transgenicznych, których genom został zmodyfikowany. Myszy, szczury, ryby, muszki owocowe, a nawet nicienie to tylko niektóre ze zwierząt, które są wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania ludzkich chorób. Choroby neurodegeneracyjne (np. choroba Alzheimera, Parkinsona), cukrzyca, choroby układu krążenia, nerek, wątroby… to tylko nieliczne przykłady tego, co jest badane na wspomnianych modelach zwierzęcych [4,5]. Eksperymenty są prowadzone na całym świecie i pozwalają lepiej poznawać naturę chorób, badać ich przyczynę. Ale to nie wszystko. Takie modele wykorzystywane są także do tego, aby badać potencjalne cele terapeutyczne, testować możliwe leki, a także poszukiwać nowych, aby potwierdzić rolę mutacji genów czy też studiować ich funkcję. Oczywiście eksperymenty na zwierzętach budzą zawsze wiele wątpliwości etycznych [6], ale korzyści z nich wynikających jest naprawdę mnóstwo.

  • Technologia CRISPR nadzieją dla chorych

CRISPR ma ogromny potencjał. Precyzyjna edycja ludzkich genów stała się rzeczywistością. Dlatego też pojawiają się liczne próby wykorzystania jej w praktyce klinicznej. Aby pomóc ludziom, którzy są dotknięci nieuleczalnymi (przynajmniej do tej pory!) chorobami o podłożu genetycznym.

Optymizmem napawają nas przykłady pacjentów chorujących na talasemię czy anemię sierpowatą. W obu przypadkach problem chorujących na te choroby genetyczne wiąże się z nieprawidłową budową białka odpowiedzialnego za transport tlenu we krwi – hemoglobiny, a konkretnie jej formy obecnej u dorosłych. Uważny czytelnik, który wie już mniej lub więcej na temat technologii CRISPR mógłby zapytać, czy możliwa jest edycja genów, odpowiedzialnych za produkcję hemoglobiny, która mogłaby spełniać swoją kluczową funkcję w organizmie. Otóż okazuje się, że jest możliwa. Chociaż jeszcze nie jest dostępna powszechnie, to badania są już prowadzone! Firma o nieprzypadkowej nazwie „CRISPR Therapeutics” wraz z amerykańskim „Vertex Pharmaceuticals” przeprowadziła edycję genów kodujących hemoglobinę u pacjentów [7]. Mówiąc dokładniej, edycję genów, które kodują formę płodową hemoglobiny, taką, która nie jest już produkowana u dorosłych ludzi, lecz ma szansę zastąpić wadliwą formę tego białka. Eksperymentalna terapia polegała na pobraniu krwiotwórczych komórek macierzystych z krwi obwodowej pacjenta i edycji ich DNA przy pomocy narzędzia CRISPR/Cas9. Po upewnieniu się, że wprowadzone zmiany w DNA są prawidłowe, umieszczono takie oto ulepszone komórki z powrotem w ciele pacjenta, aby mogły produkować hemoglobinę płodową. Wyniki pierwszych testów sugerują, że wyżej opisany zabieg mógł złagodzić niektóre objawy wspomnianych chorób. Oczywiście pacjenci tych eksperymentalnych terapii są cały czas obserwowani, abyśmy mogli mieć pewność co do rezultatów tego eksperymentu.

Kolejnym przykładem potencjalnego zastosowania CRISPR/Cas9 są immunoterapie CAR-T, którym poddawani są pacjenci onkologiczni. Podobnie jak w przykładzie opisanym powyżej, zmiany DNA dokonuje się tu nie bezpośrednio w ciele pacjenta, ale w jego komórkach, poza organizmem. Modyfikacji genetycznej są poddawane limfocyty T. Takie zmodyfikowane genetycznie limfocyty T zyskują w ten sposób nowe receptory powierzchniowe (białka), zdolne do efektywnego rozpoznawania komórek nowotworowych, pobudzając tym samym układ odpornościowy chorej osoby do walki. Konwencjonalne podejście do inżynierii genetycznej w limfocytach bazowało na retrowirusach, co skutkowało insercją nowego fragmentu DNA w przypadkowym miejscu genomu tych komórek i mogło pociągać za sobą zgubne skutki. Dzięki narzędziu CRISPR jesteśmy w stanie dokonać takiej insercji nowego fragmentu DNA niezwykle precyzyjnie. Limfocyty T zmodyfikowane przy użyciu CRISPR działają po prostu lepiej, są bardziej efektywne w walce z komórkami nowotworu oraz wolniej się męczą [8,9,10].

Dość już o zmianie DNA w laboratorium, w probówce, poza organizmem. Czas na zmianę DNA bezpośrednio w ciele człowieka!

Całkiem niedawno, po raz pierwszy na świecie, zdecydowano się na zastosowanie technologii CRISPR wewnątrz ciała ludzkiego (badanie typu in vivo). Rozpoczęto badania kliniczne dla osób chorych na wrodzoną ślepotę Lebera. Choroba ta jest spowodowana mutacjami w wielu genach, które są ważne dla prawidłowego funkcjonowania siatkówki. Jak to zwykle bywa, wady w DNA są przyczyną występowania nieprawidłowego (niefunkcjonalnego) białka lub całkowitego jego braku. A białko to jest potrzebne do procesu widzenia. Badania kliniczne, o których jest ostatnio głośno, dotyczą osób, które chorują, ponieważ ich genom posiada mutacje w jednym, bardzo konkretnym genie (CEP290). Większość ludzi będących nosicielami mutacji w tym genie rodzi się niewidoma lub traci wzrok w pierwszych latach swojego życia. Nowoczesna, testowa terapia polega na wstrzyknięciu leku pod siatkówkę oka, aby mógł on dostać się bezpośrednio do fotoreceptorowych komórek siatkówki, w których ma zadziałać. To właśnie w nich ma dokonać się edycja DNA, wyeliminowanie mutacji za pomocą „cudownego leku” bazującego na technologii CRISPR [11,12,13]. Brzmi zbyt pięknie? Być może, ale miejmy nadzieję, że w najbliższych miesiącach usłyszymy o sukcesie tych badań. Trzymamy kciuki!

Podsumowując, testy kliniczne nowoczesnych terapii z zastosowaniem narzędzia CRISPR już trwają i myślę, że możemy liczyć na to, że nowe terapie będą pojawiać się bardzo szybko, jedne po drugich!

  • Garść kontrowersji

Minęło zaledwie 7 lat od momentu, gdy naukowcy odkryli, że za pomocą CRISPR można zmieniać ludzkie geny. Czy więc to odpowiednia chwila na ingerencję molekularnymi nożyczkami w „wybrane” miejsca w genomie człowieka? Użyłam cudzysłowu nie bez przyczyny. Mimo dużej precyzyjności tej technologii może ona nieść ze sobą potencjalnie nietypowe skutki, trudne do przewidzenia. Do cięcia DNA może dojść także poza zaplanowanym miejscem (tzw. off-target effects). To zdecydowanie ryzyko, którego wolelibyśmy uniknąć. Takie cięcie poza zaplanowanym miejscem może prowadzić do niezamierzonych mutacji. Cięcie w innym, niż zaplanowane, miejscu mogłoby unieczynnić jakiś istotny dla nas gen, który jest niezbędny dla prawidłowego funkcjonowania komórek. Ale nie jesteśmy tu całkiem bezsilni. Istnieją bioinformatyczne narzędzia, które pomagają przewidzieć miejsca (przynajmniej znaczną ich większość), w których może dojść do takiego niezamierzonego cięcia. Wszystko w końcu zależy od tego, jak wygląda sekwencja DNA w miejscu, w które celujemy. Należy jednak pamiętać, że zawsze istnieje jakieś ryzyko. Ale czy taka wizja przestraszy ludzi zmagających się na co dzień z ciężkimi chorobami genetycznymi? Zapewne nie. I nie ma w tym nic dziwnego. Wszystko wydaje się w porządku, gdy przy pomocy tego nowoczesnego narzędzia inżynierii genetycznej dokonuje się naprawy określonych komórek chorych ludzi. Jeszcze bezpieczniej, gdy można zrobić to poza organizmem (badania typu ex vivo). Zanim takie przeprogramowane komórki zostaną „wydane”, możemy upewnić się, że zmiany, których dokonaliśmy w DNA są prawidłowe.

Jeśli dokonujemy modyfikacji genetycznych w komórkach somatycznych to mamy pewność, że nie będą one dziedziczone. Aby zmiany były dziedziczone, należałoby zmieniać DNA bezpośrednio w komórkach rozrodczych lub embrionach. Taka strategia teoretycznie mogłaby się przydać, gdybyśmy chcieli uchronić swoje potomstwo przed jakąś chorobą. Niestety, wtedy sytuacja staje się bardziej skomplikowana albo po prostu groźna. Zmiany w materiale genetycznym, które będą dziedziczone przez potomstwo mogą pociągać za sobą fatalne skutki. Ku przestrodze przywołam przykład pewnego chińskiego naukowca [14], który w swoim kontrowersyjnym eksperymencie dokonał edycji DNA w zygocie, komórce powstałej w wyniku zapłodnienia, w tym przypadku in vitro. Zanim umieszczono ludzki zarodek w macicy mamy, sprawdzono za pomocą sekwencjonowania, czy dokonano zamierzonych zmian w DNA i czy nie ma żadnych „off-targetów”. Po miesiącach oczekiwania urodziły się bliźniaczki. Tylko jedna posiada zaplanowaną modyfikację w genie CCR5 na obu chromosomach, która ma zapewnić jej ochronę przed infekcją wirusem HIV w przyszłości [15,16,17]. Gen CCR5 jest genem dobrze znanym i badanym od wielu lat, a wprowadzona w nim modyfikacja występuje także naturalnie u ludzi, dając im odporność na HIV. Sam autor zbyt odważnego (i ostro potępianego przez środowisko naukowe) eksperymentu podkreśla też, że tego typu modyfikacje powinny być dokonywane, aby pomóc przyszłym rodzicom ustrzec swoje dzieci przed groźnymi chorobami. Nie po to, aby wybierać im kolor włosów, oczu czy decydować o ilorazie inteligencji (czego zresztą zrobić się nie da, wbrew oczekiwaniom niektórych; przynajmniej na razie). Jednakże granica technologiczna pomiędzy tymi dwoma skrajnymi pobudkami jest tak cienka, że nie sposób się w tym nie pogubić. Jeśli zaakceptujemy „projektowanie” dzieci, to zaraz powstaną firmy oferujące wykorzystanie narzędzi CRISPR w wątpliwych etycznie celach. O ile już ich nie ma?

Jeśli ktoś ma jeszcze wątpliwości, czy powinniśmy wystrzegać się tego typu genetycznych modyfikacji, to powiem, co okazało się później. Niecały rok po narodzinach bliźniaczek w Nature Medicine [18] ukazała się praca mówiąca o tym, że taka zmiana w genomie (jak u jednej z bliźniaczek) zwiększa ryzyko przedwczesnego zgonu o 21%. Zaskakujące, prawda? Jednak parę miesięcy później okazało się, że ta informacja jest nieprawdziwa, a praca została wycofana. Dokładniejsza analiza pokazała bowiem, że nie ma dowodów na opisaną w artykule zależność (między konkretną mutacją a ryzykiem przedwczesnej śmierci) [19]. Zależność, która przecież mogła być prawdziwa. Niech ta historia będzie przestrogą dla wszystkich, którym ciężko ostudzić entuzjazm związany z wizją projektowania ludzi.

Jeszcze za wcześnie, aby wyciągnąć jednoznaczne wnioski dotyczące terapii u ludzi z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9. Takie próby podjęto na zbyt małej liczbie osób lub najzwyczajniej mogło minąć za mało czasu, aby zaobserwować jakieś skutki uboczne. Nie jesteśmy w stanie przewidzieć wszystkich konsekwencji, jakie niesie ze sobą edycja genów u ludzi. Tym bardziej, że naukowcy cały czas badają funkcję białek i tysięcy genów, a te (nawet po latach badań!) są w stanie ich zaskoczyć. Dodajmy tylko, że geny stanowią zaledwie 1-2% naszego genomu, a pozostałe 98% to wciąż w dużej mierze „ciemna materia DNA”, którą dopiero odkrywamy.

Ale czy jest to powód, aby się zatrzymać i rezygnować z potencjalnych korzyści? Pewnie nie. Kierujmy się jednak rozsądkiem i ostrożnością!

Nowoczesne technologie wykorzystane w odpowiedni sposób mogą uczynić nasze życie lepszym, wykorzystane w sposób nieodpowiedni mogą nas zgubić. Niestety, jak to zazwyczaj bywa, nie możemy mieć stuprocentowej kontroli nad tym, kto, kiedy, jak, gdzie i do jakich celów wykorzysta CRISPR… Jedno jest pewne. Nie sposób zatrzymać biegu historii lub wymazać odkryć takich, jak to opisane wyżej.

 

 

Jeśli macie jeszcze trochę czasu to polecam także:

https://www.youtube.com/watch?v=0HsFA5350Rw

https://www.youtube.com/watch?v=KrB9Ntwkn9c

 

Źródła:

[1] Zhan, T. et al. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy. Semin. Cancer Biol., 55 (2019), pp. 106-119

[2] https://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/personalized-and-targeted-therapies/what-personalized-cancer-medicine

[3] Marx, V. Choosing CRISPR-based screens in cancer. Nat Methods 14, 343–346 (2017).

[4] Allocca M. et al. The Fruit Fly, Drosophila melanogaster: Modeling of Human Diseases (Part II), Drosophila melanogaster – Model for Recent Advances in Genetics and Therapeutics, Farzana Khan Perveen, IntechOpen, 2018

[5] Giacomotto, J., Ségalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we?. British journal of pharmacology, 160(2), 204–216, (2010).

[6] Ormandy EH, Dale J, Griffin G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 2011;52(5):544‐550.

[7] www.sec.gov/Archives/edgar/data/1674416/000119312517372224/d492785dex991.htm

[8] https://www.cancer.gov/news-events/cancer-currents-blog/2017/crispr-immunotherapy

[9] https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells

[10] Chenggong Li, et al. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR T-cell therapy, Briefings in Functional Genomics,

[11] https://ir.editasmedicine.com/news-releases/news-release-details/allergan-and-editas-medicine-initiate-brilliance-phase-12

[12] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03872479

[13] https://www.nature.com/articles/d41587-018-00003-2

[14] https://www.youtube.com/watch?v=th0vnOmFltc&app=desktop

[15] https://www.nature.com/scitable/blog/viruses101/hiv_resistant_mutation/

[16] https://dzienniknaukowy.pl/czlowiek/zle-rokowania-dla-zmodyfikowanych-genetycznie-dziewczynek-z-chin-mutacja-wiaze-sie-z-ryzykiem-wczesnej-smierci

[17] https://www.youtube.com/channel/UCn_Elifynj3LrubPKHXecwQ/videos

[18] Wei, X., Nielsen, R. CCR5-∆32 is deleterious in the homozygous state in humans. Nat Med 25, 909–910 (2019)

[19] Maier, R., Akbari, A., Wei, X. et al. No statistical evidence for an effect of CCR5-∆32 on lifespan in the UK Biobank cohort. Nat Med 26, 178–180 (2020)

Podziel się: