/

Molekularne puzzle
– terapia genowa hemofili

avatar
Marta Andrzejewska 30 Paź, 6 minut czytania

Hemofilia – choroba, która nękała europejskie rody królewskie i prawdopodobnie doprowadziła do wprowadzenia na dwór rosyjski Rasputina czy przyspieszenia wybuchu rewolucji rosyjskiej. Jej fascynująca historia została przybliżona przez Jürgena Thorwalda w książce Krew królów: dramatyczne dzieje hemofilii w europejskich rodach książęcych. Ta osoczowa skaza krwotoczna to genetycznie uwarunkowana choroba objawiająca się ciężkimi krwawieniami przy najmniejszych nawet uszkodzeniach czy zadrapaniach.

Z czym zmagały się rodziny władające Europą od wieków?

Istotą hemofilii jest defekt genu odpowiadającego za produkcję czynnika krzepnięcia, konkretnie czynnika VIII (hemofilia A – najczęstsza), czynnika IX (hemofilia B) lub czynnika XI (hemofilia C). Dwie pierwsze dziedziczone są w sprzężeniu z chromosomem X (patrz przypis 1), ostatnia – autosomalnie recesywnie (przypis 2). Wszystkie podtypy charakteryzują się występowaniem krwawień. Ich ciężkość zależy jednak od stopnia niedoboru czynnika krzepnięcia – często jest tak, że jakaś śladowa jego ilość jest produkowana. Im mniej, tym oczywiście gorzej dla pacjenta. Choroba objawia się krwawieniem po zazwyczaj niezbyt niepokojącym wydarzeniu – usunięciu zęba, uderzeniu się (tutaj często występuje również krwawienie do stawów i mięśni), ale mogą występować też zagrażające życiu krwawienia wewnętrzne do jam ciała. Czasem mogą one jedynie utrudniać funkcjonowanie (np. krwotoki do stawów). Czasami zdarza się utrata dużej objętości krwi, która grozi wykrwawieniem – krwotok wewnętrzny daje objawy dopiero po pewnym czasie, kiedy leczenie szpitalne jest konieczne. Pacjent dowiaduje się o hemofilii zazwyczaj przez to, że występują u niego częste, długotrwałe krwawienia z nosa i wspomniane krwotoki do stawów czy mięśni.

https://pl.freepik.com/premium-wektory/objaw-hemofilii-infografika-w-zestawie-kol-nadmierne-krwawienie_4300034.htm

 

Przez wiele lat nie było wiadomo, jak leczyć hemofilię. Obecnie standardem jest podawanie koncentratów rekombinowanych czynników krzepnięcia (przypis 3) tak często, jak wymaga tego pacjent (zależy to m.in. od jego stylu życia i stopnia niedoboru czynnika krzepnięcia).

Czasem takie leczenie może zawodzić – jeżeli chory z całkowitym brakiem czynnika krzepnięcia przyjmie rekombinowane białko, możliwe jest rozwinięcie silnej reakcji alergicznej. Czynnik krzepnięcia identyfikowany jest przez organizm jako obce białko, które trzeba zniszczyć, co może dyskwalifikować z dalszej substytucji (przypis 4) brakującym czynnikiem krzepnięcia. U takich pacjentów leczenie jest dodatkowo skomplikowane, w zależności od poziomu przeciwciał stosuje się różne postępowanie, które wykracza poza ramy tego tekstu [1].

Brak jednoznacznie skutecznego, a przede wszystkim trwałego lekarstwa, skłonił badaczy do poszukiwania terapii genowej, która mogłaby ulżyć chorym. W końcu chodzi o wadliwy gen, zatem dokładnie to, czym zajmuje się inżynieria terapii genowych. Jej opracowanie nie należy jednak do dróg usłanych różami. Praca nad pierwszym prototypem takiej terapii trwała kilka lat i zaowocowała zbudowaniem transgenu (o którym dalej) oraz publikacją wyników w 2011 roku [2]. Prace cały czas trwają.

Warto uzmysłowić sobie, jak trudne jest opracowanie efektywnego transgenu (przypis 5), który – dostarczony za pomocą wektora – będzie mógł zastąpić defektywny gen i, w konsekwencji, leczyć chorobę.

Budowanie odpowiedniego transgenu przypomina trochę układanie molekularnych puzzli. Już na początku transgen musi być zapakowany w odpowiednie pudełko, w którym zostanie przetransportowany do wnętrza komórki. W opisywanej próbie wykorzystano wektor wirusowy związany z adenowirusami (AAV, ang. adeno-associated virus). Celem zmodyfikowanego genetycznie wirusa (wektora) są komórki wątroby, które odpowiadają za produkcję czynników krzepnięcia i wielu innych białek niesamowicie ważnych w codziennym życiu.

Tutaj jednak pojawia się pierwszy problem. Pudełko nie może być byle jakie. Nie dość, że musi być odpowiedniej wielkości, to jeszcze musi być idealnie dopasowane do przyszłego nabywcy puzzli, czyli komórek wątroby (w przypadku hemofilii). Już na początku okazało się, że czynnik VIII jest zbyt duży, by móc ,,zmieścić” DNA potrzebne do jego produkcji w wirusowym wektorze. Leczenie hemofilii A stało się chwilowo poza zasięgiem. Naukowcy skupili się zatem najpierw na opracowaniu terapii genowej na hemofilię B. Czynnik IX, a raczej DNA potrzebne do jego produkcji, okazało się być takiej wielkości, że ,,upchnięcie” go w wektorze (pudełku) było możliwe.

Pudełek jest jednak wiele – i tak samo jest w przypadku wirusów – mogą mieć one inne kapsydy, czyli otoczki. Charakteryzują się one obecnością innych białek, na które organizm biorcy może odpowiadać w różny sposób. Użyte po raz pierwszy wirusy AAV-8 okazały się być dalekie od ideału, ponieważ powodowały reakcje immunologiczne. Zmieniono więc je na AAV-2 i AAV-9, które nie indukowały nadwrażliwości, były zatem bezpieczniejsze. Jednak i tym razem nie było pełnego sukcesu – jak się okazało po pewnym czasie – te konkretne wektory nie były idealnie dopasowane do biorców. Ich niepełny tropizm, czyli wybór konkretnej tkanki przez komórki wirusa, sprawiał, że nie trafiały do wątroby. Ostatnio jednak udało się opracować taki kapsyd, który ma wysokie powinowactwo do ludzkich hepatocytów [3]. Dzięki temu wektory w końcu trafiają do celu – komórek wątroby.

I skąd tyle problemów? Wydawać by się mogło, że jeżeli pudełko jest tak problematyczne, to jego zawartość nam to wynagrodzi. Nic bardziej mylnego – mówimy o puzzlach z gatunku tych najtrudniejszych. Coś w typie ,,same niebieskie niebo i morze, 2000 elementów”.

Kilka lat zajęło naukowcom zbudowanie wyłącznie funkcjonalnego transgenu. Przewidzieć trzeba było każdy etap produkcji czynnika krzepnięcia. Zastosowano cDNA (przypis 6) zamiast natywnego DNA, co pozwoliło na pominięcie sekwencji niekodujących, niezawierających informacji o jego posttranskrypcyjnej obróbce (przypis 7). Zostały tylko najważniejsze elementy, które z równą skutecznością miały zapewnić ,,zbudowanie” funkcjonalnego białka. Dzięki temu można było zmieścić się w mniejszym pudełku. Pierwszy sukces za nami.

cDNA postawiono zatem w centrum sekwencji. Po jednej jego stronie znajduje się intron, który w procesie obróbki jest usuwany, jednak bez niego niemożliwe jest efektywne przepisanie informacji genetycznej z cDNA na mRNA, czyli niejako transport z jądra komórkowego do cytoplazmy. Te dwa duże puzzle znajdują się w kanapce promotoru (przypis 8), który opowiada za prawidłową produkcję RNA, ekspresję tylko w komórkach wątroby i stabilizację całej sekwencji oraz czapeczki poli-A (przypis 9). Całość liczy niecałe 3000 par zasad.

Schemat otrzymanego transgenu (rysunek własny wykonany na podstawie materiałów EDX The Science and Business of Biotechnology)

 

Świetnie – ułożyliśmy molekularne puzzle! Czy to koniec problemów? Oczywiście, że nie. Naukowcy spotkali ich jeszcze więcej. Na przykład wiedzą już, że geny dostarczane do komórek dzięki wektorom AAV nie integrują się z genomem gospodarza, a to znowu daje do myślenia. Czy terapia będzie zatem trwała i wystarczy jednorazowe jej podanie? Innym problemem jest pojawiający się rak wątrobowokomórkowy podczas prób na myszach. Czy tak samo będzie u ludzi? Zdecydowanie za wcześnie na celebrowanie pełnego sukcesu.

Terapia genowa dla hemofilii B wciąż pozostaje zatem niezarejestrowana. Podawana była grupom osób – z różnym skutkiem. Czasem się udawało, ale zdarzały się przypadki, w których terapia nie odnosiła zakładanego celu. W międzyczasie opracowano skróconą wersję DNA dla czynnika VIII, co daje szanse na wyprodukowanie jego mniejszego odpowiednika i jakiekolwiek nadzieje dla pacjentów z hemofilią A. Ostatnie doniesienia z Ameryki mówią jednak o wstrzymaniu przez FDA rejestracji leku Roctavian® (valoctocogene roxaparvovec), który miał być pierwszą terapią genową dla hemofilii, stawiając znak zapytania właśnie przy jej trwałości [4]. To pokazuje, że wiele jeszcze przed nami. A przed naukowcami – dużo molekularnych puzzli…

 

 

Przypisy:

  1. Dziedziczenie recesywne sprzężone z chromosomem X – inaczej sprzężone z płcią. Allele genów, które znajdują się na chromosomach płci X i Y przekazywane są do gamet. Mężczyzna ma XY, a kobieta XX. Jeżeli mężczyzna odziedziczy chromosom X z wadliwym allelem, będzie chory, zaś kobieta potrzebuje dwóch takich chromosomów, w przypadku jednego jest nosicielką.
  2. Dziedziczenie autosomalne recesywne – sposób dziedziczenia, w którym cecha ujawnia się tylko w przypadku posiadania obydwu zmienionych alleli genu i dotyczy chromosomów autosomalnych (1-22).
  3. Rekombinowany czynnik krzepnięcia (białko) – białko wyprodukowane metodami inżynierii genetycznej przy użyciu specjalnie złożonych (rekombinowanych) genów, co pozwala na wydają produkcję białek ludzkich w laboratorium.
  4. Terapia substytucyjna – podawanie zastępcze enzymu lub innego białka, którego jest brak lub za mało do spełnienia podstawowych funkcji. Przykładem jest leczenie insuliną osób z cukrzycą typu I.
  5. Transgen – gen przeniesiony z komórek jednego organizmu do innego (także wirusów) drogą naturalną lub metodami inżynierii genetycznej.
  6. cDNA – DNA wyprodukowany na zasadzie odwrotnej transkrypcji, czyli cofnięcie mRNA do DNA. Zapewnia to brak obecności sekwencji niekodujących.
  7. Obróbka posttranskrypcyjna – praca nad pre-mRNA otrzymanym w procesie transkrypcji tak, aby utworzyło dojrzały mRNA i był gotowy do transkrypcji.
  8. Promotor – odcinek DNA położony tuż przed początkiem genu, który sygnalizuje jego początek genu i zapewnia miejsce przyłączenia enzymu potrzebnego do transkrypcji.
  9. Czapeczka poli-A – sekwencja chroniąca DNA przed przypadkową degradacją.

 

Bibliografia:

[1] Interna Szczeklika. Mały podręcznik 2019/2020. Wydawnictwo Medycyna Praktyczna

[2] Nathwani, Amit C., et al. ,,Adenovirus-Associated Virus Vector–Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.” New England Journal of Medicine, vol. 365, no. 25, 2011, pp. 2357–2365., doi:10.1056/nejmoa1108046.

[3] Cabanes-Creus, Marti, et al. ,,Restoring the Natural Tropism of AAV2 Vectors for Human Liver.” Science Translational Medicine, vol. 12, no. 560, 2020, doi:10.1126/scitranslmed.aba3312.

[4] https://hemophilianewstoday.com/2020/08/19/fda-delays-decision-roctavian-hemophilia-a-gene-therapy/

 

[obrazek ze strony https://www.freepik.com/]

Podziel się: