Jak edytować DNA? O technologii CRISPR/Cas9 słów kilka

avatar
mgr Agata Jóźwiak 31 Maj, 6 minut czytania

Jeśli jeszcze nie wiesz, czym jest CRISPR lub czujesz, że ten termin nie jest dla Ciebie do końca jasny, to z pewnością powinieneś/aś nadrobić zaległości. CRISPR to technologia, która zrewolucjonizowała naukowy świat, a teraz zaczyna szturmem podbijać również świat medyczny. Z pewnością jeszcze nie raz o niej usłyszysz, więc zacznij już dziś. Zapraszam do lektury!

 

  • Niepozorne początki

CRISPR (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats; zgrupowane, regularnie oddzielone krótkie powtórzenia palindromiczne) to specyficzny region w DNA z powtarzającymi się sekwencjami, który został zauważony w genomie bakterii Escherichia coli już w 1987 r. przez grupę japońskich naukowców [1]. Wówczas nie zdawano sobie jeszcze sprawy z tego, jak duży potencjał ma to odkrycie. Zainteresowanie tematem rosło w kolejnych latach, gdy naukowcy z całego świata zaczęli odkrywać podobne sekwencje, nazwane później CRISPR [2], w genomach innych prokariotów – organizmów, które nie posiadają jądra komórkowego (wśród prokariotów wyróżniamy dwie bardzo odmiennie grupy: powszechnie znane bakterie oraz dużo słabiej poznane archeony, występujące głównie w środowiskach ekstremalnych np. gorących źródłach czy beztlenowych obszarach dna jezior).

 

  • Czym jest CRISPR i jak wygląda w genomie?

Ta „nowa rodzina powtarzalnych sekwencji DNA” została opisana w 2002 roku jako sekwencje powtórzone (ang. direct repeats, bezpośrednie powtórzenia), które są przeplatane przez inne, różniące się od siebie odcinki DNA o podobnej długości (ang. spacers) [2]. Innymi słowy – jest to klaster składający się z krótkich, powtarzalnych i identycznych sekwencji, które oddzielają krótkie, różnorodne odcinki DNA o podobnej długości (Rys.1).

 

Rys. 1. Budowa locus (patrz przypis 1) CRISPR. Sekwencje powtórzone (Repeats) zostały przedstawione kolorem pomarańczowym, a sekwencje przeplatające (Spacers) zostały oznaczone różnymi kolorami (zielony, żółty, fioletowy).

Źródło: https://www.jyi.org/2018-november/2018/11/1/the-biology-of-native-and-adapted-crispr-cas-systems

 

Odkryto również, że bliskim sąsiadem CRISPR w genomie są geny kodujące tzw. białka Cas (ang. CRISPR-associated, związane z CRISPR) o aktywności helikaz (patrz przypis 2) czy egzonukleaz (patrz przypis 3), zdolne, aby rozplatać i ciąć DNA [2]. Główną zagadką pozostała odpowiedź na pytanie, czym są i jaką rolę pełnią tajemnicze, różniące się od siebie odcinki nazwane Spacers, znajdujące się między sekwencjami identycznymi, nazwanymi Repeats w obrębie CRISPR. Trzy lata później zostały one zidentyfikowane jako fragmenty DNA należące do wirusów [3,4,5]. Były to małe kawałki ich genomów, które zostały wbudowane w genom bakteryjny w regionie CRISPR.

Szybko udowodniono, że CRISPR wraz z białkami Cas działa u bakterii jako swoisty system odpornościowy, a owe różnorodne sekwencje (Spacers) w jego obrębie pełnią rolę pewnej bazy danych na temat atakujących je fagów (patrz przypis 4) [6].

 

  • Trochę szczegółów

Po procesie transkrypcji (patrz przypis 5) regionu CRISPR powstają crRNA (CRISPR RNA), które łączą się z białkiem Cas w kompleks i pełnią rolę jego przewodnika [7]. Nakierowują białko Cas o aktywności enzymatycznej na konkretne miejsce w genomie wirusa, które może być następnie przez to białko pocięte, tym samym powodując jego „śmierć”. Wirus nie jest organizmem żywym, więc śmierć w tym przypadku będzie oznaczała po prostu jego trwałą deaktywację, unieczynnienie.

Badania prowadzone na bakterii Streptococcus pyogenes ujawniły, że nakierowujące crRNA składa się zarówno z sekwencji powtórzeniowej (Repeat), jak i z z sekwencji wirusowej (Spacer) i, aby mogło działać w naturze, potrzebowało także jeszcze jednego elementu: tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA), który brał udział w dojrzewaniu cząsteczki crRNA i był komplementarny do jego części Repeat [8]. Wraz z białkami typu Cas, crRNA oraz tracrRNA formują kompleks zdolny do tego, aby wykonać cięcie w konkretnym miejscu genomu wirusa. Ten natywny system bardzo dobrze prezentuje Rysunek 2.

Rys. 2. Natywny system CRISPR typu II.

Źródło: https://www.jyi.org/2018-november/2018/11/1/the-biology-of-native-and-adapted-crispr-cas-systems

  • Przełomowa sekwencja PAM

Szybko zorientowano się, że krytycznym wymogiem dla funkcjonalnego systemu CRISPR/Cas jest obecność sekwencji specjalnej, którą nazwano PAM (ang. protospacer-adjacent motif) w genomie wirusa. Jest to sekwencja, która przylega do regionu „Protospacer” w wirusie, który jest włączany przez maszynerię CRISPR do bakteryjnego genomu jako „Spacer” [9]. Taką prostą sekwencją jest na przykład 5’- NGG -3’, która stanowi sekwencję PAM dla systemu CRISPR/Cas9 typu II, odkrytego w bakterii Streptococcus pyogenes [10]. Są to trzy zasady azotowe (N – dowolna zasada oraz dwie guaniny – G) czytane w kierunku od 5’ do 3’, a system CRISPR/Cas9, pochodzący z S. pyogenes jest jednym z najczęściej używanych ze względu na wymóg krótkiej sekwencji NGG. Sekwencje PAM są niezwykle ważne, ponieważ to właśnie one determinują nam możliwe miejsca cięcia w docelowym DNA.

 

  • Zaprzęganie konia do bryczki

Ale jak właściwie system CRISPR/Cas9 stał się narzędziem inżynierii genetycznej? Przełomowym odkryciem okazała się praca z 2012 roku, w której naukowcy stworzyli syntetyczne sgRNA (single guide RNA). Była to pewnego rodzaju chimera tracrRNA:crRNA, zdolna nakierować białko Cas9 na specyficzne cięcie w DNA [10]. Rok później inny zespół opublikował artykuł dotyczący stosowania tego systemu w komórkach eukariotycznych [11]. Pamiętając o wymogu obecności PAM, świat naukowy dostał do ręki narzędzie, pozwalające wykonywać cięcia w DNA w ściśle określonych miejscach, możliwych do zaprojektowania. CRISPR/Cas9 stał się wówczas technologią edycji genomu, cennym narzędziem inżynierii genetycznej.

Pozwolę sobie przyrównać w tym miejscu system CRISPR/Cas9 do bryczki jadącej w wybranym przez prowadzącego ją naukowca kierunku. Lejce mogą symbolizować sgRNA, które pozwala dążyć w odpowiednim kierunku na mapie genomu. Przystanki, na których woźnica może się zatrzymać, to sekwencje PAM występujące w genomie, a konie to białka Cas.

 

  • Reakcja DNA na molekularne nożyczki

Gdy wybierzemy upragnione miejsce w DNA, zaprojektujemy poprawnie sgRNA i zadbamy o to, aby w pobliżu odpowiadającej mu sekwencji w genomie, w który chcemy wycelować, było obecne PAM, wtedy białko Cas9 może dokonać cięcia. Cięcie to pozostawi pęknięcie na obu niciach DNA, które oznaczamy skrótem DSB (ang. double strand break/s).

DSBs są naprawiane przez komórkę na drodze dwóch systemów naprawy DNA. Pierwszy, nazywany NHEJ (ang. non-homologous end joining), polega na łączeniu ze sobą dwóch końców DNA, ale proces ten podatny jest na błędy. Podatny, ponieważ naprawa odbywa się bez użycia żadnego szablonu. Prawdopodobne staje się wówczas, że w miejscu, w którym było DSB zostaną wprowadzone jakieś mutacje. Mutacje typu indel (ang. insertion/deletion) mogą pojawić się w miejscu złącza dwóch uprzednio rozerwanych nici DNA.

Drugi mechanizm, określany jako bardziej dokładny, nazwany HDR (ang. homology directed-repair), polega na naprawie pęknięcia na podstawie obecnego szablonu. Szablonem może być odpowiadający temu miejscu fragment chromatydy siostrzanej czy też fragment chromosomu homologicznego lub obcy fragment DNA, wprowadzony do komórki przez naukowca. Aby naprawa cięcia mogła być wykonana na podstawie sztucznie wprowadzonego szablonu, musi on zawierać na swoich końcach sekwencje identyczne do tych już obecnych w obrębie cięcia, ale w swoim środku może zawierać zupełnie nową sekwencję nukleotydową, nową informację genetyczną! Naprawa HDR, przeprowadzona na podstawie takiego „obcego” szablonu, umożliwia insercję nowego fragmentu DNA w miejsce przez nas pożądane [12].

Wykonanie takiego cięcia DNA daje nam niesamowite możliwości. Realna staje się korekta wad genetycznych, przynajmniej w teorii. Dokonując dwóch cięć w danej odległości możemy pozbyć się niechcianego fragmentu DNA (mechanizm NHEJ). Dostarczając szablon, jesteśmy w stanie wstawiać do genomu zupełnie nową informację genetyczną w oparciu o mechanizm HDR. Aplikacje systemu CRISPR wydają się nieskończone. O paru przykładowych zastosowaniach opowiem w swoim kolejnym artykule.

Rys. 3. Naprawa DSBs poprzez mechanizm NHEJ oraz HDR.

Źródło: https://www.nature.com/articles/s41467-018-04252-2

 

 

 

Przypisy:

  1. locus – określona pozycja lub obszar na chromosomie
  2. helikazy – enzymy zdolne do zrywania wiązań wodorowych między parami zasad w kwasach nukleinowych, powodując ich rozplatanie
  3. nukleazy – enzymy przecinające wiązanie fosfodiestrowe między nukleotydami w kwasach nukleinowych
  4. fagi – wirusy atakujące bakterie
  5. transkrypcja – proces polegający na przepisaniu informacji genetycznej z DNA na RNA

 

Źródła:

[1] Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M. & Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 169, 5429–5433 (1987)

[2] Jansen, R. . Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 43, 1565–1575 (2002)

[3] Mojica, F. J. et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 60, 174–182 (2005).

[4] Bolotin, A. et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology 151, 2551–2561 (2005).

[5] Pourcel, C. et al. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 151, 653–663 (2005).

[6] Barrangou, R. et al. CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes. Science, 315(5819), 1709–1712 (2007).

[7] Brouns, S. J. et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science 321, 960–964 (2008).

[8] Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602–607 (2011)

[9] Deveau, H. et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190, 1390–1400 (2008).

[10] Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816–821 (2012).

[11] Ran, F. A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013)

[12] Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat. Commun. 9, 1911 (2018)

 

Podziel się: