Jak nie zniszczyć sobie DNA?

avatar
Dr Joanna Stojak 31 Mar, 6 minut czytania

DNA to wrażliwy twardziel, który potrafi przetrwać tysiące, a nawet miliony lat, ale tylko w odpowiednich warunkach. Okazuje się, że wystarczy chwila nieuwagi i degradacja DNA gotowa. W laboratorium niezwykle ważne jest prawidłowe pobranie, zabezpieczenie, przechowywanie i analizowanie materiału biologicznego, niezależnie od celu badań. Nie ma zatem nic gorszego niż zniszczenie próbki w wyniku błędu ludzkiego. Można jednak temu zapobiec, stosując się do kilku prostych zasad.

 

Kwas deoksyrybonukleotydowy (DNA) to wrażliwy twardziel. Potrafi przetrwać tysiące, a nawet miliony lat. Ale jak każdy ma swoje humory i potrzebuje odpowiednich warunków, by nie zostać zniszczonym. A to nietrudna sztuka! Czasem wystarczy chwila nieuwagi i degradacja DNA gotowa. Oto wskazówki jak tego uniknąć!

 

Kapsuła czasu

Najstarszy wyizolowany DNA liczy ponad milion lat. W 2021 roku naukowcom udało się go wyekstrahować z mamuta [1]. Antyczny DNA (aDNA) zdradził wiele tajemnic z przeszłości i pomógł rozwiązać mnóstwo zagadek. Na przykład pozwolił zidentyfikować wymianę genów między ludźmi współczesnymi a Neandertalczykami czy opisać proces domestykacji wielu gatunków [2, 3]. Mimo wieku i znacznej degradacji aDNA, współczesne metody umożliwiły poskładanie z wielu malutkich fragmentów genomów różnych wymarłych gatunków [4], udało się także uzyskać genomy naszych krewniaków i ludzi z różnych populacji, na przykład Wikingów [2, 5-7]. Dzięki aDNA dosłownie cofamy się daleko w przeszłość, by śledzić procesy ewolucyjne i zmienność genetyczną, w odpowiedzi na różne wydarzenia i zmiany klimatu [8].

Jednak nie z każdej starej próby można wyizolować DNA. Wszystko zależy od tego, w jakich warunkach przeleżała analizowana tkanka. Nietrudno zauważyć, że niemalże wszystkie zakończone sukcesem izolacje zostały wykonane ze szczątków (kości, zmumifikowane tkanki) znalezionych albo w jaskiniach, albo w wiecznej zmarzlinie.

Aby DNA mogło przetrwać wieki, potrzebna jest odpowiednia wilgotność i temperatura. Wilgoć i upały sprzyjają procesom gnilnym, kiedy to bakterie i produkowane przez nie enzymy bardzo szybko rozkładają białka i DNA. To dlatego DNA lepiej konserwuje się w zimnym klimacie, niż w tropikach [4]. Naukowcy pokusili się nawet o obliczenie ile wynosi czas połowicznego rozpadu cząsteczki DNA. Dokonano tego w oparciu o analizy kości wymarłych gigantycznych ptaków moa, których wiek wynosił między 6 a 8 tysięcy lat. Kości pochodziły z trzech różnych miejsc, zlokalizowanych w promieniu 5 kilometrów między sobą i charakteryzujących się identycznymi warunkami środowiskowymi, łącznie z temperaturą, która wszędzie wynosiła 13.1 stopni Celsjusza. Porównanie stopnia degradacji DNA w próbach wykazało, że czas połowicznego rozpadu dla cząsteczki mitochondrialnego DNA o długości 242 par zasad (zatem czas po jakim rozpadnie się połowa połączeń między nukleotydami) wynosi 521 lat. Ujawniono także, że jądrowy DNA degraduje co najmniej dwa razy szybciej niż DNA mitochondrialny! Na tej podstawie zespół oszacował, że nawet przy temperaturze -5 stopni Celsjusza, wszystkie wiązania w cząsteczce DNA ostatecznie zostałyby zniszczone w ciągu 6,8 miliona lat, a odczyt informacji genetycznej niemożliwy staje się dużo wcześniej, bo już po upływie 1,5 miliona lat, kiedy to DNA jest już bardzo pofragmentowany [9]. Zatem nici z poznaniem DNA dinozaurów!

Zabezpieczając materiał do badań, czy to bardzo stary, czy współczesny (pobierany do codziennych analiz laboratoryjnych, niezależnie czy będą to testy diagnostyczne, analizy kryminalistyczne czy badania podstawowe), należy przechowywać go w chłodnym pomieszczeniu (najlepiej w temperaturze -20 stopni Celsjusza i niższej), dobrze też, jeśli materiał nie jest wilgotny, tylko podsuszony w sterylnych warunkach (nie na kaloryferze!). Materiału do badań nie trzyma się zatem na biurku w foliowej torebce (chociaż i takie cuda widziałam!), bo temperatura pokojowa i procesy rozkładu rozprawią się z kwasami nukleinowymi bardzo szybko (1-3 dni). Należy również pamiętać, że DNA lubi ciemności – niszczy go ostre światło i promieniowanie ultrafioletowe (UV). Oznacza to, że degradację spowoduje standardowo używana do zachowania czystości w laboratorium lampa UV, jak i bezpośrednie działanie słońca.

W tym miejscu warto wspomnieć także o ultradźwiękach, które uszkadzają DNA, ale… zostały oswojone w laboratorium. Ultradźwięki to fale akustyczne, których nie słyszymy, ponieważ ich częstotliwość jest wyższa niż 16 kHz (ale niższa niż 100 MHz). Niszczą błony komórkowe, dlatego są wykorzystywane w dezynfekcji, na przykład do skutecznego niszczenia drobnoustrojów. W laboratorium jednak znaleziono dla nich inne zastosowania. Po pierwsze, doskonale sprawdzają się w homogenizacji materiału biologicznego (czyli „zmielenia” i nadania im jednolitej konsystencji, szczególnie przydatne przy rozbijaniu materiału trudnego do rozbicia ręcznie). Ultradźwięki niszczą błony komórkowe i uwalniają zawartość komórek. Po drugie, ultradźwięki rozrywają nici kwasów nukleinowych, dlatego stosuje się je w sonikacji – procesie kontrolowanego fragmentowania DNA. Jak to działa? Fragmentacja DNA jest ważnym etapem podczas tworzenia bibliotek genomowych, używanych między innymi w procesie sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Długość tych fragmentów jest ściśle określona i fragmentacja musi być wykonana bardzo precyzyjnie. Jedną z metod jest fragmentacja enzymatyczna, czyli cięcie DNA genomowego na mniejsze kawałki przy użyciu enzymów restrykcyjnych (endonukleaz, które przecinają nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA). Drugą metodą, zapewniającą nie tylko wysoką precyzję, ale i powtarzalność wyników jest właśnie sonikacja, czyli akustyczna obróbka próbek pod wpływem wytworzonych wibracji. W zależności od temperatury, amplitudy i czasu trwania pulsacji uzyskuje się zazwyczaj fragmenty o długości 100-600 par zasad [10].

W tym miejscu wyprzedzę wszystkie pytania o zastosowanie ultradźwięków w metodzie obrazowania ultrasonografem (USG). W ultrasonografii medycznej wykorzystywane są fale akustyczne o częstotliwości z zakresu ok. 2–50 MHz, ich wnikanie jest bezbolesne, a rozchodzenie nie uszkadza komórek. Generowana fala ultradźwiękowa jest przetwarzana w impulsy elektryczne. W przeciwieństwie do promieni rentgenowskich (o których kilka słów niżej), badanie ultrasonograficzne jest całkowicie bezpieczne.

 

Weź nie mutuj!

Do uszkodzenia nici DNA dochodzi nie tylko w próbkach laboratoryjnych i materiale pobranym do badań, ale również w żywych komórkach, także naszych organizmów. Czynniki niszczące DNA prowadzą do powstawania mutacji, a wysoka ekspozycja na ich działanie skutkuje między śmiercią komórek (apoptozą) czy nowotworzeniem, pomimo sprawnie działających systemów naprawy DNA [11, 12]. Mutageny można podzielić na dwie grupy – fizyczne i chemiczne.

Pierwszym czynnikiem fizycznym jest wspomniane już promieniowanie UV, które wnika w głąb tkanki i tam natrafia na atomy, które pod wpływem rozproszenia promieniowania ulegają wzbudzeniu, czyli są wybijane z zewnętrznych orbit do poziomów o wyższej energii. Prowadzi to do powstawania dimerów, czyli zmian w strukturze DNA, uniemożliwiających prawidłowe przeprowadzenie procesu replikacji. DNA niszczą także inne typy promieniowania – elektromagnetyczne i jonizujące (gamma, rentgenowskie), które powodują na przykład wycinanie nukleotydów pirymidynowych (cytozyny C i/lub tyminy T) i rozerwanie cząsteczek DNA (promieniowanie X). Niszcząca siła zależy od czasu ekspozycji i dawki napromieniowania [12].

Czynników chemicznych indukujących mutacje w DNA jest naprawdę bardzo dużo i nie sposób je wszystkie wymienić. Zaliczamy do nich między innymi silne kwasy i zasady, metale ciężkie. Warto również wspomnieć o barwnikach akrydynowych, których płaskie cząsteczki interkalują między zasady azotowe w DNA, wypychając je i skutkując poślizgiem polimerazy podczas replikacji. DNA niszczą również silne detergenty, pestycydy i zawarty w dymie tytoniowym benzopiren [12].

Jak widać, na nasz DNA czyha wiele pułapek.

 

Podsumowanie

Wróćmy jednak do laboratorium, gdzie niezwykle ważne jest prawidłowe pobranie, zabezpieczenie, przechowywanie i analizowanie materiału biologicznego, niezależnie od celu badań. Nie ma nic gorszego niż zniszczenie próbki w wyniku błędu ludzkiego (chociaż pewnie każdemu się to przydarzyło)!

Najważniejsze jest, aby nie doszło do ekspozycji materiału biologicznego na jeden z wielu degradujących DNA czynników (m. in. wysoką temperaturę, wysoką wilgotność, czynniki fizyczne i chemiczne). Ważne jest również, aby materiał biologiczny został pobrany w sterylnych warunkach i odpowiednio zabezpieczony (ochrona nie tylko przed degradacją DNA, ale i kontaminacjami!). Próby biologiczne można mrozić w niskich temperaturach (-20 stopni Celsjusza, w ciepłym azocie) lub wysuszyć (kości, skóry eksponatów muzealnych), można także stosować do ich zabezpieczania specjalne roztwory stabilizujące i chroniące kwasy nukleinowe (w tym przypadku ważne jest, aby fragment tkanki nie był za duży i aby został cały dobrze nasączony roztworem) [13].

Dbałość o DNA, także nasz własny, naprawdę się opłaca!

 

Literatura

[1] van der Valk T, Pečnerová P, Díez-Del-Molino D, Bergström A, Oppenheimer J, Hartmann S et al. (2021) Million-year-old DNA sheds light on the genomic history of mammoths. Nature 591(7849): 265-269.

[2] Green RE, Krause J, Briggs AW, Maricic T, Stenzel U, Kircher M et al. (2010) A draft sequence of the Neandertal genome. Science 328(5979): 710-722.

[3] MacHugh DE, Larson G, Orlando L (2017) Taming the past: ancient DNA and the study of animal domestication. Annual Review of Animal Biosciences 5: 329-351.

[4] Shapiro B (2021) Life as we made it: How 50,000 Years of Human Innovation Refined—and Redefined—Nature. Basic Books.

[5] Meyer M, Kircher M, Gansauge MT, Li H, Racimo F, Mallick S et al. (2012) A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual. Science 338(6104): 222-226.

[6] Margaryan A, Lawson DJ, Sikora M, Racimo F, Rasmussen S, Moltke I (2020) Population genomics of the Viking world. Nature 585(7825): 390-396.

[7] Llamas B, Willerslev E, Orlando L (2017) Human evolution: a tale from ancient genomes. Philosophical Transactions of the Royal Society B 372(1713): 20150484.

[8] Orlando L, Gilbert MT, Willerslev E (2015) Reconstructing ancient genomes and epigenomes. Nature Reviews Genetics 16(7): 395-408.

[9] Allentoft ME, Collins M, Harker D, Haile J, Oskam CL, Hale ML et al. (2012) The half-life of DNA in bone: measuring decay kinetics in 158 dated fossils. Proceedings. Biological sciences 279(1748): 4724-4733.

[10] Knierim E, Lucke B, Schwarz JM, Schuelke M, Seelow D (2011) Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. PLoS One 6(11): e28240.

[11] Brown TA (2019) Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

[12] Kodym A, Afza R (2003) Physical and chemical mutagenesis. Methods in Molecular Biology 236: 189–204.

[13] https://www.thermofisher.com/pl/en/home/brands/product-brand/rnalater.html

 


Fakty i Mity Genetyki tworzone są przez pasjonatów, specjalistów w swoich dziedzinach.
Ten artykuł czytasz za darmo, bez reklam, bez spamu. Doceń naszą pracę i postaw nam wirtualną kawę 🙂
Dziękujemy! – Wasza Redakcja FiMG

Postaw mi kawę na buycoffee.to


Podziel się: