/

Długa historia
krótkiej reakcji PCR

avatar
Dr Joanna Stojak 26 Kwi, 5 minut czytania

Lubię sobie wyobrażać, że wszystkie historie wielkich odkryć wyglądają podobnie – ktoś siedzi pod drzewem, spada mu na głowę jabłko i rozlega się radosne „Eureka!”. Albo jedzie się w pełnym słońcu trasą wzdłuż Oceanu Spokojnego, gdzieś w Kalifornii i nagle wpada na pomysł, jak powielać łańcuchy DNA na zawołanie (z cyklu: „zrób to sam, tylko nie w domu”). Tak zaczyna się historia powstania łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).

Zacznijmy jednak od początku.

Jak dostać Nobla

W 1953 roku James Watson i Francis Crick publikują swoją przełomową pracę, w której opisują strukturę kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) i za którą oczywiście dostają Nagrodę Nobla. Od tej pory wszyscy wiedzą, że DNA to dwie komplementarne nici, biegnące w przeciwnych kierunkach i skręcające się w helisę. Już wtedy Watson i Crick zauważają, że taka budowa sprawia, że materiał genetyczny z łatwością może być kopiowany i powielany [1].

I tak oto zaczyna się nowa era, era DNA. Bardzo szybko Arthur Kronberg rozpoczął badania nad mechanizmem replikacji tej niezwykłej cząsteczki i już w 1957 roku mógł się pochwalić nowym odkryciem – oto zidentyfikował pierwszą polimerazę DNA, enzym katalizujący syntezę DNA, czyli inaczej mówiąc: enzym dobudowujący kolejne, komplementarne do matrycy nukleotydy [2, 3]. Ta polimeraza powielała jednak DNA tylko w jednym kierunku. Dalsze badania Kronberga, nagrodzonego oczywiście Noblem, pokazały jak skomplikowany jest w rzeczywistości proces replikacji DNA. Wymaga przecież nie tylko matrycy, polimerazy DNA i składników budujących nowe łańcuchy, ale także krótkich sekwencji początkowych (później nazywanych starterami) czy białek rozwijających podwójną helisę i utrzymujących ją w takim stanie przez odpowiedni okres, pilnując przy tym, aby startery odczepiły się na czas i nie plątały się „pod nogami”.

Kolejne cegiełki, przydatne w opracowaniu reakcji PCR zostały dostarczone przez kolejnych (a jakże!) Noblistów: Hara Gobinda Khorana, który w swoich badaniach nad kodem genetycznym zaczął stosować syntetyczne oligonukleotydy (fragmenty kwasów nukleinowych o długości zwykle od kilkunastu do kilkudziesięciu nukleotydów) [4, 5] oraz Fredericka Sangera, który w 1977 roku opublikował przepis na sekwencjonowanie DNA, czyli metodę umożliwiającą poznanie struktury kwasu deoksyrybonukleinowego w oparciu o oligonukleotydy, polimerazę DNA i zmodyfikowane prekursory nukleotydów, które blokowały dalsze wydłużanie się sekwencji [6].

W międzyczasie w gejzerach Parku Narodowym Yellowstone odkryto zupełnie nowy gatunek bakterii, Thermus aquaticus, z której w 1976 roku wyizolowano kolejną polimerazę DNA, polimerazę Taq. Ta polimeraza, wytrzymała na wysokie temperatury (dużo bardziej niż Polimeraza I z E. coli) i aktywna jedynie powyżej 75°C, zrewolucjonizowała reakcję PCR [7, 8].

No dobrze, na arenie historii pojawiły się już wszystkie składniki niezbędne do przeprowadzenia PCR. Czy zatem poszło jak z płatka?

Oczywiście, że… nie!

Proces łudząco podobny do reakcji PCR, oparty na systemie dwóch sekwencji starterowych, opisano po raz pierwszy w 1971 roku (zrobił to Norweg, Kjell Kleppe) [9]. Jednak to zatrudniony w kalifornijskiej firmie Cetus Corporation Kary Mullis (który korzystał z publikacji Kleppe) uznawany jest za twórcę reakcji PCR i to on otrzymał Nagrodę Nobla (w 1986 roku).

Kary Mullis na co dzień pracował nad syntezą oligonukleotydów, ale chciał także opracować metodę alternatywną do metody Sangera. Pewnego dnia, jadąc autostradą nr 128 zrozumiał, co powinien zrobić. Zatrzymał się na wysokości 46.7 mili i na kolanie notował swoje przemyślenia [10]. Eureka!

Mullis natychmiast zaczął realizować swój pomysł (od razu po weekendzie!). Dodał do reakcji drugi starter, aby jednocześnie powielać dwie nici DNA. W ten sposób, dzięki wielokrotnemu podgrzewaniu i ochładzaniu próbki powinien w każdym kolejnym cyklu uzyskać dwa razy więcej łańcuchów DNA niż miał w poprzednim. Co więcej, taka reakcja pozwalałaby amplifikować dowolny fragment DNA. Początkowo Mullis zakładał, że polimeraza DNA sama sobie poradzi i zrobi co do niej należy, bez względu na temperaturę reakcji, szybko jednak zrozumiał, że należy wprowadzić cykle termalne. Pierwsze wyniki swoich eksperymentów Mullis zaprezentował podczas konferencji w Monterey, ale… nikogo tym nie zainteresował. Nie poddał się jednak, mimo iż bardzo długo żaden produkt reakcji nie był widoczny na żelu po rozdziale elektroforetycznym. Każdy, kto pracuje z elektroforezą na pewno rozumie ich frustrację. Ostatecznie udało się udowodnić, że reakcja PCR działa, wykorzystując metodę hybrydyzacji Southerna (Southern blot, metoda wykrywająca określone fragmenty DNA [11]). Kolejne modyfikacje uwzględniały użycie termostabilnej polimerazy Taq i coraz bardziej specyficznych starterów. W końcu autorzy ujrzeli swoje rezultaty na żelu po elektroforezie!

Wyniki nie zainteresowały czasopisma Nature (które natychmiast odrzuciło artykuł, bez podania przyczyny), ale bardzo szybko zostały opublikowane w innych czasopismach naukowych [10, 12-14]. Mullis uzyskał patent na reakcję PCR, a w 1985 roku wyprodukowano pierwszy termocykler, ułatwiając pracę w laboratorium (spróbujcie sami przeprowadzić PCR w łaźniach wodnych, precyzyjnie przekładając probówki z jednej temperatury do drugiej kilkadziesiąt razy w odpowiednim tempie!).

W 1989 roku czasopismo Science nagrodziło polimerazę Taq i wykorzystującą ją reakcję PCR, a publikacja prezentująca metodę stała się jedną z najpoczytniejszych w historii biologii [15]. To wtedy właśnie rząd Stanów Zjednoczonych wystosował do autorów list, ganiący ich za publikowanie informacji o „reakcjach łańcuchowych” bez zgody władzy. Jak łatwo się domyślić, naukowcy musieli natychmiast wyjaśnić różnice między reakcją PCR a… bombą atomową. Historia PCR pełna jest takich ciekawych wydarzeń. Na przykład w dniu wygłaszania mowy noblowskiej Mullis o mało nie został aresztowany przez szwedzką policję za… nieodpowiednie użycie laserowego wskaźnika.

W 1991 roku firma Cetus została sprzedana (wraz z patentami PCR) firmie Hoffman-La Roche.

Podsumowanie

Dziś łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest szybka, skuteczna i powszechna, nie należy zapominać jednak, że jest kluczowa w wielu badaniach. PCR jest fundamentem genomiki, analizy ekspresji genów, kryminalistyki, paleontologii i ochrony przyrody. Bez reakcji PCR nie udałoby się powielać antycznego DNA, badać historii ewolucyjnej człowieka i wszystkich żyjących na Ziemi organizmów. Bez PCR nie byłoby także diagnostyki klinicznej. To PCR stanowi przecież podstawę w wykrywaniu COVID-19. Co ja się będę rozpisywać – bez PCR nie byłoby nauk biologicznych, medycznych i środowiskowych. I tyle. Nie da się przed nią uciec.

 

Literatura:

[1] Watson JD, Crick FHC. 1953. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737-738.

[2] Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A. 1958. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 233(1): 163-170.

[3] Kresge N, Simoni RD, Hill RL. 2005. Arthur Kornberg’s discovery of DNA Polymerase I. Journal of Biological Chemistry 280: E46-E48.

[4] Khorana HG, Agarwal KL, Besmer P, Büchi H, Caruthers MH, Cashion PJ, Fridkin M, et al. 1976. Total synthesis of the structural gene for the precursor of a tyrosine suppressor transfer RNA from Escherichia coli. 1. General introduction. Journal of Biological Chemistry 251(3): 565-570.

[5] Panet A, Khorana HG. 1974. Studies on polynucleotides. Journal of Biological Chemistry 249(16): 5213-5221.

[6] Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74(12): 5463-5467.

[7] Brock TD, Freeze H. 1969. Thermus aquaticus, a nonsporulating extreme thermophile. Journal of Bacteriology 98(1): 289-297.

[8] Chien A, Edgar DB, Trela JM. 1976. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. Journal of Bacteriology 174: 1550-1557.

[9] Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG. 1971. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. Journal of Molecular Biology 56: 341-361.

[10] Mullis KB. 1990. The unusual origins of the Polymerase Chain Reaction. Scientific American 262: 56-65.

[11] Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 98(3): 503-517.

[12] Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51: 263-273.

[13] Mullis KB, Faloona FA. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction. Methods in Enzymology 155(F): 335-350.

[14] Mullis KB, Ferré F, Gibbs RA. (Eds.) 1994. The Polymerase Chain Reaction. Boston, Birkhäuser Press.

[15] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491.

 

Podziel się: