Jak wygląda postępowanie diagnostyczne, gdy mamy podejrzenie któregoś z zespołów mitochondrialnych?
Oczywiście to zależy z jakimi objawami mamy do czynienia, ale zwykle nie zaczynamy od diagnostyki molekularnej, ale od testów biochemicznych krwi i moczu. Testem z wyboru jest badanie poziomu kwasu mlekowego w surowicy, powinniśmy też wykonać podstawowe badania morfologiczne, badanie ogólne moczu, poziom glukozy, kinazy kreatynowej i hormony tarczycy. Postępowanie takie jest zasadne, ponieważ diagnoza chorób mitochondrialnych jest diagnozą z wykluczenia. Nie jest ona zwykle pierwszym ani najbardziej oczywistym stawianym rozpoznaniem.
W przypadku chorób mitochondrialnych poziom mleczanu w surowicy często jest podwyższony, zaś aktywność kinazy kreatynowej jest w zakresie wartości referencyjnych lub tylko nieznacznie podwyższona. Jest to jedna z cech różnicujących defekty w mtDNA od miopatii o innym podłożu, w których KK jest często wyraźnie podwyższona. Co istotne, u dzieci zwykle uszkodzenia mięśni szkieletowych nie są jeszcze tak zaawansowane, by wartości powyższych parametrów różniły się drastycznie od wartości prawidłowych [4]. Dodatkowe badania hormonów, enzymów, parametrów hematologicznych pozwalają wykryć anomalie często towarzyszące zespołom mitochondrialnym, które mogą mieć skrajnie różną manifestację. Ważne może się okazać także badanie równowagi kwasowo-zasadowej np. w diagnostyce zespołu MELAS, przebiegającego z kwasicą mleczanową.
Poza surowicą krwi, badanie poziomu mleczanu oraz pirogronianu wykonać można także z moczu i płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR). Warto wspomnieć, że istnieje także możliwość wykrywania innych kwasów organicznych i ich metabolitów w moczu, takie badania wykonuje się często przy podejrzeniach różnych blokad metabolicznych, chorób spichrzeniowych i w przypadku podejrzenia jakiejkolwiek innej choroby genetycznej o nieznanym podłożu. Wytyczne amerykańskie wspominają także o wykrywaniu wolnych aminokwasów w PMR oraz acylokarnityn w surowicy [1]. Badania te wykonuje się w specjalistycznych laboratoriach, najczęściej przy użyciu gazowej chromatografii ze spektrometrią mas (GC-MS). Laboratoria prowadzące diagnostykę chorób rzadkich posiadają możliwość wykonania takiej analizy i dysponują odpowiednim sprzętem, czasami współpracują w tym celu z uczelniami wyższymi.
Podwyższone stężenie kwasu mlekowego i anomalie w obrębie innych parametrów biochemicznych wraz z obrazem klinicznym kierują nas na tory bardziej szczegółowej diagnostyki. Tym razem patomorfologicznej. Dla diagnostyki różnicowej chorób nerwowo-mięśniowych powinna zostać wykonana ocena histopatologiczna bioptatu mięśnia, która niestety jest procedurą inwazyjną. Skrawki barwione są cytochemicznie na kilka sposobów:
Standardowe barwienie HE (hematoksylina-eozyna) jest używane do oceny morfologii włókien, stopnia ich atrofii, obecności przejaśnień wokół komórek, kształtów jąder komórkowych, wakuolizacji itd. W preparatach barwionych trichomem Gomoriego szukamy zmienionych morfologicznie włókien mięśniowych, tzw. “włókien szmatowatych” (ang. rugged‚ znaczy dosłownie poszarpane, zużyte lub zeszmacone), w których dochodzi do nadprodukcji defektywnych mitochondriów i ich gromadzenia na peryferiach komórki. Włókna mięśniowe mają zmieniona morfologia, ich kontury są potargane (stąd nazwa), dochodzi także stopniowo do dysplazji i atrofii poszczególnych włókien. Preparat wykonujemy z tkanki mrożonek, nieutrwalanej. Szczegóły barwienia są świetnie opisane na stronie Neuromuscular Disease Center.
Dwa kolejne barwienia cytochemiczne uwidaczniają aktywność: oksydazy cytochromowej oraz dehydrogenazy bursztynianianowej, pośrednio pozwalając nam wnioskować o aktywności mitochondriów i łańcucha oddechowego. Wyniki tych badań są różne w zależności od rodzaju choroby mitochondrialnej i typu układu w obrębie łańcucha oddechowego, który uległ uszkodzeniu. Wybarwiając jeden skrawek oboma technikami naraz można wnioskować o lokalizacji defektu genetycznego- jądrowej bądź mitochondrialnej co jest niezwykle ważne dla późniejszej szybkiej diagnostyki genetycznej i poradnictwa genetycznego.
Co ciekawe, jedna z często używanych technik wizualizacji patologii włókien mięśni szkieletowych jest mikroskopia elektronowa, choć jest to trudna w interpretacji i standaryzacji technika i nie jest uznana jako wiarygodna przez część ośrodków.
Barwienia tkanki mięśniowej nie zawsze pokażą nam zmiany z racji różnych proporcji populacji mitochondriów zmutowanych i prawidłowych. Dlatego badanie hist-pat można rozszerzyć o inne narządy- w wyjątkowych sytuacjach można wykonać biopsję wątroby, mięśnia sercowego a nawet mózgu, czy też w zespole Pearsona- trepanobiopsję szpiku kostnego [2].
Ostatnim elementem diagnostyki chorób mitochondrialnych jest scharakteryzowanie defektu genetycznego leżącego u podstaw choroby. W tym celu wykonuje się albo sekwencyjnie tradycyjne badania metodą long-range PCR oraz sekwencjonowanie Sangera najczęstszych wariantów patogennych, albo stosuje się od razu sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Wydaje się, że NGS niedługo wyprze powolną i mało efektywną, a przy tym nie aż taką znowu tanią, klasyczną diagnostykę. Tradycyjne sekwencjonowanie, poza tym że pracochłonne dla dużych amplikonów, wykazuje niską czułość (>15% zmutowanej matrycy) co obniża jej wiarygodność w przypadku heteroplazmii. Wykonywanie wielokrotnych analiz dla kolejnych pojedynczych mutacji w nieoczywistych przypadkach to strzelanie kulą w płot, angażuje dużo czasu i sporo pieniędzy, nie mówiąc już o przedłużaniu się czasu do uzyskania porady i diagnozy przez pacjenta. Metodą NGS wykryjemy zarówno małe mutacje w mtDNA, jak i delecje i deplecje, a przy okazji zbadany jądrowe geny mitochondrialne. Stąd istnieje potrzeba zwiększenia dostępności tego typu badań w naszym kraju.
Literatura:
(fragment tekstu autorki „Kiedy elektrownia jest zepsuta” opublikowanego na blogu molekularnie.wordpress.com)