Diagnostyka chorób mitochondrialnych

avatar
Dr Marzena Wojtaszewska 30 Gru, 3 minut czytania

 

Jak wygląda postępowanie diagnostyczne, gdy mamy podejrzenie któregoś z zespołów mitochondrialnych?

Oczywiście to zależy z jakimi objawami mamy do czynienia, ale zwykle nie zaczynamy od diagnostyki molekularnej, ale od testów biochemicznych krwi i moczu. Testem z wyboru jest badanie poziomu kwasu mlekowego w surowicy, powinniśmy też wykonać podstawowe badania morfologiczne, badanie ogólne moczu, poziom glukozy, kinazy kreatynowej i hormony tarczycy. Postępowanie takie jest zasadne, ponieważ diagnoza chorób mitochondrialnych jest diagnozą z wykluczenia. Nie jest ona zwykle pierwszym ani najbardziej oczywistym stawianym rozpoznaniem.

W przypadku chorób mitochondrialnych poziom mleczanu w surowicy często jest podwyższony, zaś aktywność kinazy kreatynowej jest w zakresie wartości referencyjnych lub tylko nieznacznie podwyższona. Jest to jedna z cech różnicujących defekty w mtDNA od miopatii o innym podłożu, w których  KK jest często wyraźnie podwyższona. Co istotne, u dzieci zwykle uszkodzenia mięśni szkieletowych nie są jeszcze tak zaawansowane, by wartości powyższych parametrów różniły się drastycznie od wartości prawidłowych [4]. Dodatkowe badania hormonów, enzymów, parametrów hematologicznych pozwalają wykryć anomalie często towarzyszące zespołom mitochondrialnym, które mogą mieć skrajnie różną manifestację. Ważne może się okazać także badanie równowagi kwasowo-zasadowej np. w diagnostyce zespołu MELAS, przebiegającego z kwasicą mleczanową.

Poza surowicą krwi, badanie poziomu mleczanu oraz pirogronianu wykonać można także z moczu i płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR). Warto wspomnieć, że istnieje także możliwość wykrywania innych kwasów organicznych i ich metabolitów w moczu, takie badania wykonuje się często przy podejrzeniach różnych blokad metabolicznych, chorób spichrzeniowych i w przypadku podejrzenia jakiejkolwiek innej choroby genetycznej o nieznanym podłożu. Wytyczne amerykańskie wspominają także o wykrywaniu wolnych aminokwasów w PMR oraz acylokarnityn w surowicy [1]. Badania te wykonuje się w specjalistycznych laboratoriach, najczęściej przy użyciu gazowej chromatografii ze spektrometrią mas (GC-MS). Laboratoria prowadzące diagnostykę chorób rzadkich posiadają możliwość wykonania takiej analizy i dysponują odpowiednim sprzętem, czasami współpracują w tym celu z uczelniami wyższymi.

Podwyższone stężenie kwasu mlekowego i anomalie w obrębie innych parametrów biochemicznych wraz z obrazem klinicznym kierują nas na tory bardziej szczegółowej diagnostyki. Tym razem patomorfologicznej. Dla diagnostyki różnicowej chorób nerwowo-mięśniowych powinna zostać wykonana ocena histopatologiczna bioptatu mięśnia, która niestety jest procedurą inwazyjną. Skrawki barwione są cytochemicznie na kilka sposobów:

Standardowe barwienie HE (hematoksylina-eozyna) jest używane do oceny morfologii włókien, stopnia ich atrofii, obecności przejaśnień wokół komórek, kształtów jąder komórkowych, wakuolizacji itd. W preparatach barwionych trichomem Gomoriego szukamy zmienionych morfologicznie włókien mięśniowych, tzw. “włókien szmatowatych” (ang. rugged‚ znaczy dosłownie poszarpane, zużyte lub zeszmacone), w których dochodzi do nadprodukcji defektywnych mitochondriów i ich gromadzenia na peryferiach komórki. Włókna mięśniowe mają zmieniona morfologia, ich kontury są potargane (stąd nazwa), dochodzi także stopniowo do dysplazji i atrofii poszczególnych włókien. Preparat wykonujemy z tkanki mrożonek, nieutrwalanej. Szczegóły barwienia są świetnie opisane na stronie Neuromuscular Disease Center.

Dwa kolejne barwienia cytochemiczne uwidaczniają aktywność: oksydazy cytochromowej oraz dehydrogenazy bursztynianianowej, pośrednio pozwalając nam wnioskować o aktywności mitochondriów i łańcucha oddechowego. Wyniki tych badań są różne w zależności od rodzaju choroby mitochondrialnej i typu układu w obrębie łańcucha oddechowego, który uległ uszkodzeniu. Wybarwiając jeden skrawek oboma technikami naraz można wnioskować o lokalizacji defektu genetycznego- jądrowej bądź mitochondrialnej co jest niezwykle ważne dla późniejszej szybkiej diagnostyki genetycznej i poradnictwa genetycznego.

Co ciekawe, jedna z często używanych technik wizualizacji patologii włókien mięśni szkieletowych jest mikroskopia elektronowa, choć jest to trudna w interpretacji i standaryzacji technika i nie jest uznana jako wiarygodna przez część ośrodków.

Barwienia tkanki mięśniowej nie zawsze pokażą nam zmiany z racji różnych proporcji populacji mitochondriów zmutowanych i prawidłowych. Dlatego badanie hist-pat można rozszerzyć o inne narządy- w wyjątkowych sytuacjach można wykonać biopsję wątroby, mięśnia sercowego a nawet mózgu, czy też w zespole Pearsona- trepanobiopsję szpiku kostnego [2].

Ostatnim elementem diagnostyki chorób mitochondrialnych jest scharakteryzowanie defektu genetycznego leżącego u podstaw choroby. W tym celu wykonuje się albo sekwencyjnie tradycyjne badania metodą long-range PCR oraz sekwencjonowanie Sangera najczęstszych wariantów patogennych, albo stosuje się od razu sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Wydaje się, że NGS niedługo wyprze powolną i mało efektywną, a przy tym nie aż taką znowu tanią, klasyczną diagnostykę. Tradycyjne sekwencjonowanie, poza tym że pracochłonne dla dużych amplikonów, wykazuje niską czułość (>15% zmutowanej matrycy) co obniża jej wiarygodność w przypadku heteroplazmii. Wykonywanie wielokrotnych analiz dla kolejnych pojedynczych mutacji w nieoczywistych przypadkach to strzelanie kulą w płot, angażuje dużo czasu i sporo pieniędzy, nie mówiąc już o przedłużaniu się czasu do uzyskania porady i diagnozy przez pacjenta. Metodą NGS wykryjemy zarówno małe mutacje w mtDNA, jak i delecje i deplecje, a przy okazji zbadany jądrowe geny mitochondrialne. Stąd istnieje potrzeba zwiększenia dostępności tego typu badań w naszym kraju.

 

Literatura:

[1] Pankh, Goldstein i wsp. Diagnosis and management of mitochondrial disease: a consensus statement from the Mitochondrial Medicine Society. Genetics in medicine 2015

[2] Koenig MK. Presentation and Diagnosis of Mitochondrial Disorders in Children. Pediatric neurology 2011

[3] Zhou i wsp. A Novel Next-Generation Sequencing–Based Approach for Concurrent Detection of Mitochondrial DNA Copy Number and Mutation. The Journal of Molecular Diagnostics 2020

 

(fragment tekstu autorki „Kiedy elektrownia jest zepsuta” opublikowanego na blogu molekularnie.wordpress.com)

Podziel się: