CFTR, czyli jeden z najczęściej badanych genów w świecie diagnostyki genetycznej

avatar
Magda Kopczyńska 21 Lut, 7 minut czytania

W populacji europejskiej mutacje w genie CFTR występują średnio u jednego dziecka na 2500 urodzeń, a nosicielem wadliwego genu jest co 25 osoba. Uszkodzony gen najczęściej przyczynia się do rozwoju choroby zwanej mukowiscydozą. W 1938 roku, kiedy to pierwszy raz opisano tę chorobę, długość życia chorego od momentu diagnozy wynosiła zaledwie 5 lat; dziś pacjenci dożywają nawet do 40 roku życia. Jak postęp genetyki przyczynił się do tak spektakularnego sukcesu terapeutycznego?

Mutacja w CFTR a pływanie w basenie

W genie CFTR zakodowana jest informacja o budowie białka, które jest odpowiedzialne za transportowanie jonów chloru oraz cząsteczek wody. Białka te są obecne w błonie komórek nabłonka w takich narządach jak trzustka, płuca oraz jelita. W przypadku mutacji, produkowane białko najczęściej jest uszkodzone, nie ma zdolności przewodzenia jonów bądź nie jest w stanie zakotwiczyć się w błonie z powodu nieprawidłowego kształtu. Może też nie powstawać w ogóle, jednak w takim przypadku mutacja ta jest często letalna (przypis 1)[1]. Fizjologicznie prowadzi to do kumulowania się jonów chloru wewnątrz komórek i zatrzymaniu w nich wody. To w konsekwencji przyczynia się do powstawania w płucach bardzo gęstej wydzieliny, która powoduje poważne problemy w oddychaniu. Wydzielina ta tworzy też idealne środowisko do rozwoju bakterii, dlatego też istnieje zwiększone ryzyko infekcji. Nie tylko płuca są objęte chorobą – mutacja w CFTR powoduje też niewydolność trzustki, która objawia się niedożywieniem i brakiem przyrostu masy ciała, a ponadto może rozwinąć się współtowarzysząca mukowiscydozie cukrzyca. Co więcej, 95% chorych mężczyzn cechuje bezpłodność, która wynika albo z całkowitego zaniku nasieniowodów, albo z ich niedrożności. W tym drugim przypadku w drogach wyprowadzających nasienie następuje produkcja gęstego śluzu, który utrudnia produkcję plemników.

Rys. 1 Schematyczna wizualizacja kanału chlorkowego, kodowanego przez gen CFTR. Na rysunku nr 1 białko działa poprawnie – jony chlorkowe i cząsteczki wody przepływają swobodnie z i do wnętrza komórki. Rysunek 2 przedstawia sytuację, w której białko zakotwiczone jest w błonie, jednak pozostaje zablokowane, przyczyniając się np. do powstawania gęstej wydzieliny.
Źródło: https://en.wikipedia.org/wiki/Cystic_fibrosis_transmembrane_conductance_regulator#/media/File:CFTR_Protein_Panels.svg

Życie dziecka chorego na mukowiscydozę jest pełne wyzwań i niedogodności. Gęstej, lepkiej wydzieliny z płuc trzeba się pozbywać co najmniej dwa razy dziennie – wymaga to serii „uderzeń” w klatkę piersiową, które powodują jej odrywanie. Do odciągania śluzu używa się specjalnej aparatury. Często wymaga to od dziecka prowadzenia indywidualnego toku nauki, jest więc nieco wyłączone z normalnego dziecięcego życia. Wyjazdy na letnie obozy są wykluczone, gdyż te są idealnym miejscem do rozpowszechniania się między dziećmi różnych drobnoustrojów chorobotwórczych. Nawet pozornie niewinna letnia zabawa z wężem ogrodowym czy pistoletem na wodę może zakończyć się tragedią, ponieważ bytują tam bakterie z rodzaju Pseudomonas, które uwielbiają zagnieżdżać się w płucach.  Nawet pływanie w basenie jest niewskazane – duża ilość chloru w wodzie podrażnia układ oddechowy, a z kolei zbyt mała powoduje, że żyje tam wiele bakterii, mogących zapoczątkować infekcję.

Podłoże genetyczne

W każdej komórce naszego ciała występują dwa allele (przypis 2) danego genu – jeden pochodzący od matki, drugi od ojca. Mukowiscydoza jest chorobą dziedziczoną w sposób autosomalny recesywny, co oznacza, że gen CFTR znajduje się na chromosomie zwanym autosomem (przypis 3), a ujawnia się jedynie w sytuacji, kiedy dziecko odziedziczy dwa uszkodzone allele genu. W przypadku, kiedy jeden z nich jest prawidłowy, a drugi uszkodzony, dziecko nie zachoruje, ale będzie nosicielem choroby. Jeśli oboje rodzice są zdrowi, ale są nosicielami nieprawidłowego allelu genu CFTR, istnieje 25% szans na to, że każde ich dziecko urodzi się chore (Rys. 2).

Rys. 2 Dziedziczenie w przypadku chorób autosomalnych recesywnych. Do góry zobrazowani są rodzice nosiciele. Uwzględniając taki rozkład genotypów ich dziecko może być: w 25% chore (kolor biały), w 25% zdrowym nie-nosicielem (kolor niebieski), w 50% zdrowym nosicielem (kolor biały i niebieski).
Źródło: https://pl.wikipedia.org/wiki/Dziedziczenie_autosomalne_recesywne#/media/Plik:Autosomal_recessive_-_en.svg

Mukowiscydoza jako choroba została opisana pod koniec lat 30-tych, jednak identyfikacji defektu molekularnego leżącego u jej podstaw dokonała dopiero w 1989 roku Karem Batsheva z Uniwersytetu w Toronto.  Od tego czasu odnotowano ponad 1600 różnych mutacji w genie CFTR. Najbardziej powszechną jest mutacja ΔF508, notowana w 56% przypadków zachorowań. To właśnie ta mutacja została opisana przez wyżej wymienioną autorkę w artykule dla Science Magazine. Polega ona na delecji (przypis 4) trzech nukleotydów, powodując tym samym „wypadnięcie” jednego aminokwasu z łańcucha, który tworzy białko. Skutkuje to przyjęciem nieprawidłowego kształtu (konformacji) przez białko CFTR i tym samym brakiem możliwości zakotwiczenia białka w błonie komórkowej.

Obecnie już po 10 tygodniu ciąży można wykonać badania prenatalne w kierunku diagnozy mukowiscydozy. Skierowanie na takie badania mogą otrzymać kobiety, które m. in. ukończyły 35 rok życia lub jeśli u któregoś z partnerów w rodzinie występowały choroby genetyczne, w szczególności mukowiscydoza. W Polsce wykonuje się w takiej sytuacji biopsję kosmówki i materiał ten bada się pod względem najczęściej występujących mutacji w genie CFTR.  Istnieje też nieinwazyjna metoda badań, którą można wykonać prywatnie – NIPT/NIFTY test. Polega ona na pobraniu krwi żylnej od matki i wyizolowaniu z niej wolnokrążącego DNA płodu. Technika ta cechuje się możliwością sprawdzenia dużej ilości potencjalnych mutacji u płodu dzięki wykorzystaniu nowoczesnych metod sekwencjonowania oraz analiz bioinformatycznych.

Diagnoza i co dalej?

Po zdiagnozowaniu choroby u dziecka pozostaje najczęściej leczenie objawowe, ponieważ nie ma skutecznej metody leczenia mukowiscydozy na poziomie genetycznym. Szereg czynności terapeutycznych związanych z układem oddechowym obejmuje m.in. inhalacje antybiotykami oraz wykonywanie tzw. „drenażu oskrzelowego”, który polega na opisanym już wcześniej „opukiwaniu” klatki piersiowej. Może być do tego wykorzystywana też specjalna wibrująca kamizelka. Problemy z niedożywieniem, które wynikają z dysfunkcji trzustki, rozwiązywane są najczęściej specjalną dietą, w której do posiłku dodaje się enzymy trawienne.

Istnieje jednak sposób, by leczyć przyczynę choroby, a nie tylko jej objawy. Do tego jednak niezbędne jest określenie, jaka dokładnie mutacja pojawiła się w genie CFTR u danego dziecka, ponieważ mogą one w różny sposób upośledzać działanie białka. W 2012 roku amerykańska FDA (ang. Food and Drug Administration) zatwierdziła do użytku lek iwakaftor (w sprzedaży jako Kalydeco), który pozwala na efektywny transport jonów chloru przez białko, ale tylko w przypadku, kiedy CFTR jest już zakotwiczone w błonie i pozostaje zablokowane. Związane jest to z konkretną mutacją (G551D), która dotyczy tylko 5% chorych.

Co więc z przypadkami chorych na mukowiscydozę, którzy cechują się najczęstszą mutacją ΔF508? W tym przypadku sam iwakaftor na niewiele się zda, gdyż uszkodzone białko przez swój nieprawidłowy kształt nie jest w stanie wejść w strukturę błony komórkowej – nawet jeśli działałoby poprawnie, to i tak nie wypompuje chlorków poza wnętrze komórki. W tym celu opracowano modyfikację opisanej wyżej metody: iwakaftor łączy się z lumakaftorem (w sprzedaży jako Orkambi) – druga z substancji działa jak pewnego rodzaju rusztowanie, które pozwala na prawidłowe uformowanie białka CFTR. Jeśli białko ma prawidłowy kształt,  może tym samym wpasować się w kompozycję błony komórkowej, a iwakakaftor usprawni przepływ jonów.

Rys. 3 Białko CFTR o prawidłowej strukturze (po lewej) znajduje się w błonie komórkowej. Jednak przyjęcie nieprawidłowej konformacji (po prawej) powoduje, że białko nie może zakotwiczyć się w błonie komórkowej.
Źródło: Ricki Lewis. Human Genetics. Concepts and Applications. New York, 2015.

Wyzwania dla terapii

Mimo, że komercyjnie dostępne leki (jak Kalydeco i Orkambi) cechują się całkiem dobrą skutecznością, istnieje wiele ograniczeń, które uniemożliwiają ich stosowanie. Chyba najważniejszym z nich jest w tym przypadku cena – roczną terapię na pacjenta w przypadku Kalydeco wyceniono w 2017 roku na 311 000$, a Orkambi na 272 000$. Nie trudno się domyślić, że rzadko kto może sobie pozwolić na tak drogie leczenie.

W fazie badań klinicznych jest też kilka terapii genowych (przypis 5), których celem jest dostarczenie do komórek prawidłowej kopii genu CFTR. Takie postępowanie terapeutyczne jest względnie nowym podejściem i stoi pod znakiem zapytania. Z jednej strony ma wiele zalet, jak np. fakt, że taka terapia mogłaby być zastosowana jednorazowo. Bezpośrednio eliminowałaby też przyczynę choroby. Niesie jednak ze sobą duże ryzyko, biorąc pod uwagę np. losowość włączania się interesującego nas genu w DNA w komórkach chorego. Może to prowadzić do przerwania ciągłości w kodowaniu ważnego białka, a tym samym objawić się inną dysfunkcją metaboliczną czy nawet doprowadzić do procesu nowotworzenia.

W celu wyeliminowania możliwości losowego włączania materiału genetycznego, można wykorzystać w terapii genowej określone rodzaje wirusów. To właśnie wirusy są wykorzystywane do dostarczenia genu terapeutycznego do komórek organizmu, ponieważ posiadają naturalną zdolność do wstrzykiwania swojego DNA lub RNA do wnętrza komórek gospodarza. Jednak znacznie lepszą metodą wydaje się wykorzystanie technologii CRISPR-Cas. Jest to narzędzie wykorzystywane do inżynierii genetycznej, które ma zdolność edycji genów z niebywałą precyzją. Cały mechanizm opiera się na modelu reakcji odpornościowej bakterii przed atakującymi ją wirusami (przypis 6). W tym momencie działa już kilka grup badawczych zajmujących się wykorzystanie technologii CRISPR-Cas w leczeniu mukowiscydozy, jednym z nich jest zespół Guilii Maule z Uniwersytetu w Trento. Z racji innowacyjności metody, badania opierają się na razie o organoidy (przypis 7) powstałe dzięki komórkom pobranym od chorych. Wyniki są zadowalające – dane wskazują na to, że dwie mutacje, na których pracuje zespół są całkowicie naprawione, a białko produkowane jest przez komórki poprawnie.

Najlepszym leczeniem jest profilaktyka

Szacując średnią częstość mutacji genu CFTR w Europie na 1 na 2500 urodzeń, w średniej wielkości mieście w Polsce, takim jak Poznań, w 2017 roku urodziła się trójka dzieci z ze zmutowaną wersją tego genu. Ocenia się, że w całej Polsce żyje ponad 2000 chorych, jednak liczba ta może być dużo większa ze względu na to, że przez wiele lat nie prowadzono żadnego rejestru. Przyjmując, że średnio 1 na 25 osób jest nosicielem, dla samego Poznania daje to 20000 osób będących nosicielami choroby! Istnieje zatem duża szansa, że dwójka nosicieli spotka się z zamiarem założenia rodziny. Nawet w przypadku, w którym dwójka rodziców jest nosicielami innych mutacji, jeśli dziecko odziedziczy oba zmutowane allele genu, to i tak białko CFTR będzie uszkodzone. W genetyce taki stan rzeczy nazywamy heterozygotycznością złożoną. Jest on przyczyną wielu chorób, które nie są łatwe do wykrycia poprzez standardową diagnostykę genetyczną.

Warto więc spojrzeć wgłąb swojego drzewa genealogicznego, by wyciągnąć z niego jak najwięcej informacji. Istnieje wiele możliwości wykonania badań na nosicielstwo. Z taką wiedzą potencjalni rodzice są w stanie świadomie planować posiadanie potomstwa. Natomiast badania prenatalne pod kątem mutacji w CFTR mogą się przyczynić do wdrażania odpowiedniego postępowania terapeutycznego już od pierwszych dni życia dziecka.

 

————-

Przypisy:

  1. Śmiertelna już w okresie zarodkowym.
  2. Allel to jedna z dwóch wersji genu w komórkach naszego organizmu.
  3. Do autosomów zaliczamy wszystkie chromosomy danego organizmu z wyjątkiem chromosomów płci. Liczba wszystkich chromosomów u człowieka wynosi 46, w tym dwa z nich to chromosomy płci. Posiadamy zatem 44 autosomy.
  4. Delecja jest to zmiana w materiale genetycznym, która polega na utracie jego fragmentu.
  5. Terapia genowa jest leczeniem, które polega na wprowadzeniu obcego kwasu nukleinowego do komórek/organizmu. Wprowadzone w ten sposób DNA/RNA powinno wywrzeć efekt terapeutyczny, czyli „zmusić” komórki do produkowania białka, kodowanego przez dane DNA/RNA. Najczęściej wykorzystuje się do tego celu nieszkodliwe dla organizmu wirusy.
  6. Mechanizm działania CRISPR-Cas najlepiej zwizualizować sobie oglądając film: https://www.youtube.com/watch?v=jAhjPd4uNFY
  7. Organoid to zminiaturyzowany i uproszczony model organu stworzony w warunkach in vitro.

Podziel się: