Biobankowanie:
jak przechowuje się materiał biologiczny? Część I: Materiał tkankowy

avatar
Dr Marzena Wojtaszewska 29 Kwi, 4 minuty

Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do późniejszego wykorzystania, wreszcie dla celów terapeutycznych. Dla niektórych typów materiałów istnieje consensus co do sposobu przechowywania, natomiast dla innych nie ma żadnych konkretnych wytycznych i tylko od personelu laboratorium i posiadanego sprzętu zależy, jak i czy w ogóle jest on biobankowany.

Dzisiaj zajmiemy się materiałami tkankowymi i komórkowymi.

 

1. Krioprezerwacja żywotnych linii komórek eukariotycznych, gamet i komórek macierzystych.

Zachowanie w dobrej kondycji wrażliwych, osłoniętych jedynie błoną plazmatyczną komórek zwierzęcych jest nie lada wyzwaniem. Oczywiście zatrzymanie ich metabolizmu jest możliwe jedynie poprzez zamrożenie, jednak woda podczas mrożenia tworzy kryształy, które niczym włócznie przebijają na wskroś mrożone komórki. Dlatego procedura mrożenia jest bardzo ściśle określona i wymaga specjalistycznej aparatury.

Komórki przed mrożeniem są delikatnie traktowane, odpłukiwane z medium hodowlanego, zastępowanego roztworem zawierającym krioprezerwant (najszerzej używanym jest DMSO, chociaż wybór środka zależy od typu komórek). Jego rolą jest niedopuszczenie do tworzenia się kryształów i  do nadmiernego obkurczania się komórek w stanie zamrożenia.

Samo zamrażanie musi być na tyle szybkie, żeby komórki nadmiernie się nie obkurczyły, ale na tyle wolne, by nie doprowadzić do ich lizy. Komórki ssacze najczęściej poddaje się mrożeniu z szybkością 1-3 stopni Celcjusza na minutę, schładzając je docelowo do temperatury poniżej -130 stopni.

Jest jeszcze druga technika zamrażania, zwana witryfikacją, czyli zeszkleniem. Polega ona na tak szybkim zamrożeniu komórek, by ich roztwór zamienił się nie w kryształy lodu, ale w amorficzne ciało stałe podobne do szkła. Odbywa się to poprzez nagłe włożenie do ciekłego azotu i nadanie ruchu próbce podczas zamrażania, tak by ciekły azot maksymalnie szybko odbierał jej ciepło.

Przechowywanie żywotnych komórek po zamrożeniu odbywa się albo w oparach ciekłego azotu, w temperaturze od -140 do -180 stopni, albo w damej cieczy (-196 stopnie).

Rozmrażanie komórek polega najczęściej na raptownym rozgrzaniu do 37 stopni i szybkim odpłukaniu środka konserwującego, by nie dopuścić do zatrucia komórek i szoku osmotycznego.

Tego typu postępowanie stosowane jest na potrzeby medycyny w akredytowanych bankach hematopoetycznych komórek macierzystych i bankach krwi oraz bankach nasienia. W biotechnologii krioprezerwację komórek roślinnych i zwierzęcych wykorzystuje się na przykład do przechowywania kolekcji kultur komórkowych.

 

2. Żywotne linie bakteryjne i drożdżowe

Bakterie i drożdże, z racji mniej skomplikowanego metabolizmu, naturalnych przystosowań do trudnych warunków środowiska i posiadania ściany komórkowej, łatwiej jest zachować przy życiu w stanie zamrożenia.  Oczywiście są mikroby wrażliwe, wymagające odpowiedniego przygotowania przed krioprezerwacją, jednak poczciwe E. coli, czy S. cerevisiae, jak i wiele innych gatunków nie wymagają skomplikowanych procedur.

Kolonie w fazie wzrostu logarytmicznego (nigdy w fazie stacjonarnej ani obumierania!) zwirowuje się i zawiesza w 15% roztworze glicerolu. Voila, teraz po prostu nasze bakterie przechowujemy w -20 stopniach.

Do krótkotrwałego przechowywania (kilkudniowego) można wykorzystać schładzane w lodówce szalki lub skosy agarowe, czasami także podłoża płynne.

Istnieje także możliwość wysuszenia naszych mikroogranizmów z zachowaniem częściowej żywotności (nawet >50%) przy użyciu specjalnej aparatury do sublimacji. W zamrożeniu z kultur odparowywana jest woda, dzięki czemu otrzymujemy liofilizat, który może być przechowywany przez długi czas w zamrożeniu czy też nawet w temperaturze pokojowej bez dostępu wody. Tą technologią suszone są dobrej jakości drożdże piekarskie i winiarskie, które kupujemy w saszetkach w sklepach spożywczych.

 

3. Ekstrakty komórkowe

Ekstrakty komórkowe nie muszą być utrzymane przy życiu, dlatego istnieje wiele sposobów na ich przechowywanie.

Jeżeli zależy nam jedynie na genomowym lub plazmidowym DNA, można po prostu zawiesinę lub tkankę zamrozić w zbuforowanej soli fizjologicznej lub etanolu. Mniej kłopotliwe w transporcie są liofilizaty, które bez dostępu wody można przechowywać w temperaturze pokojowej lub w lodówce.

Jeżeli planujemy wyizolować z lizatu po dluzszym czasie RNA, powinniśmy zastosować specjalny bufor koagulujący białka, taki jak RNAlater lub PAXgene, albo zastosować odczynnik Chomczyńskiego-Sachi.

Do otrzymania lizatów o jakości wystarczającej do badań białek należy się bardziej przyłożyć. Jeżeli nasze eksperymenty zakładają użycie zdenaturowanych polipeptydów- nie ma większego problemu, wystarczy inhibicja proteolizy i zamrożenie lizatu. Jeżeli natomiast potrzebne nam są białka natywne, postępujemy z reguły tak, jak z hodowlami komórkowymi- zawieszamy lizat w odpowiednim buforze (zawiera inhibitory proteaz, chelatory i/lub krioprotektanty), następnie zanurzamy w ciekłym azocie i przechowujemy w co najmniej -70 stopniach. Jeżeli białka które badamy są  stabilne (np. kolageny) lub występują w dużych ilościach w komórce (albuminy, kazeina), możemy spróbować liofilizacji jako tańszej i mniej kłopotliwej alternatywy. Przechowywanie krótkoterminowe lizatów białkowych w lodówce (od kilku dni do nawet miesiąca czasu) jest możliwe przy zastosowaniu buforów zawierających substancje bakteriobójcze i inhibitory proteaz.

 

4. Wycinki tkankowe i bioptaty

Konserwacja skrawków do badań histopatologicznych jest standardowo wykonywana w pracowniach patologii i polega na maceracji wycinka tkankowego w zbuforowanym roztworze 10% formaliny, następnie zaś zatopieniu skrawka w kostce parafiny. Tzw. „bloczki” parafinowe można przechowywać latami bez dużej utraty właściwości biologicznych. O ile RNA w takich kostkach ulega szybkiej fragmentacji i w dużym stopniu degradacji, o tyle chromatyna jądrowa i większość białek (aczkolwiek ulegają uszkodzeniom i usieciowaniu) pozostaje zachowana w dobrym stanie. Możliwe jest więc prowadzenie niektórych analiz DNA (FISH, PCR, panelowy NGS) oraz części badań immunohistochemicznych i histochemicznych. By przygotować preparat mikroskopowy i wybarwić tkankę należy z bloczka odciąć na mikrotomie odpowiedniej szerokości skrawki, „odparafinować” je i uwodnić z użyciem ksylenu, etanolu i wody oraz wybarwić.

Krótkotrwałe (kilka dni lub tygodni) przechowywanie preparatów tkankowych możliwe jest w zbuforowanym roztworze formaliny, choć z czasem jakość takich preparatów ulega pogorszeniu.

 

5. Rozmazy cytologiczne

W zależności od typu rozmazu (szpik i krew obwodowa, materiał z biopsji aspiracyjnych BAC, cytologia ginekologiczna, rozmazy płynów wysiękowych itd.) stosuje się różne techniki wykonywania rozmazów i różne barwienia. Przechowywanie takich rozmazów polega w dużym uogólnieniu na przygotowaniu niebarwionych szkiełek z naniesionym odpowiednio materiałem w kilku (co najmniej 2) powtórzeniach, dobrym osuszeniu szkiełek, a następnie archiwizacji ich w suchym i ciemnym pomieszczeniu. Materiał utrwalony na szkiełkach zwykle nadaje się do barwień cytochemicznych, czasami możliwe jest otrzymanie małych ilości DNA z takich próbek do badań molekularnych, ale jest ono znacznie gorszej jakości (i w mniejszej ilości) niż z bloczków parafinowych. Różnie bywa z oznaczeniami białek: są one często mocno zdenaturowane i mogą nie wykazywać właściwości antygenowych niezbędnych np. do immunolokalizacji niektórymi przeciwciałami mono, a nawet poliklonalnymi.

Preparaty barwione  barwnikami strąceniowymi można czsto przechowywać w ciemnym pomieszczeniu przez dłuższy czas, jednak część barwień blaknie już po kilku dniach (np. FAG) lub tygodniach (barwienia immunofluorescencyjne, np. FISH)

 

6. Jądra komórkowe do techniki FISH

Do badań cytogenetycznych wykorzystuje się bioptaty tkankowe lub świeże zawiesiny komórkowe. Gdy nie jest możliwe wykonanie badania FISH od razu, lub gdy zaistnieje potrzeba przechowania prób pochodzących z zawiesiny komórek w hematoonkologii), można je przechować w dwojaki sposób: albo w postaci utrwalonych, niewybarwionych szkiełek przechowanych w < -70 stopniach  lub jako zawiesina jąder komórkowych utrwalona w mieszaninie metanol-kwas octowy. Taką zawiesinę przechowuje się w zamrożeniu. Jest ta preferowana metoda do badań hematoonkologicznych, gdyż hybrydyzacja jest wówczas bardziej efektywna niż po nałożeniu sondy na gotowe, przemrożone szkiełka.

Co do skrawków parafinowych do FISH, postępowanie nie różni się od tego opisanego w punkcie 4.

 

Źródła:

  1. Doświadczenia własne

2. Pegg DE. Principles of Cryopreservation. In: Day JG, Stacey GN, eds. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. Methods in Molecular BiologyTM. Totowa, NJ: Humana Press; 2007:39-57. doi:10.1007/978-1-59745-362-2_3

3. Yong WH, ed. Biobanking: Methods and Protocols. Humana Press; 2019. doi:10.1007/978-1-4939-8935-5

 

Podziel się: