Analiza jakości i ilości kwasów nukleinowych za pomocą spektrofotometru kroplowego — protokół

avatar
Dr Marzena Wojtaszewska 29 Cze, 5 minut czytania

Wiele laboratoriów ma problem z izolacją RNA, czasami także i DNA. Ten wstępny etap może zaważyć na powodzeniu lub klęsce całej serii badań, ponieważ zanieczyszczenia kwasów nukleinowych będą przeszkodą dla późniejszych reakcji enzymatycznych. Dlatego niezwykle ważna jest kontrola jakości i ilości kwasów nukleinowych. Jednym z najpowszechniejszych sposobów oceny stężenia i stopnia zanieczyszczenia DNA i RNA jest analiza spektrofotometryczna w zawieszonej kropli.

 

Cel: określenie czystości DNA i RNA po izolacji.

 

Wprowadzenie: po skończonej izolacji kwasów nukleinowych musimy wiedzieć jakie jest stężenie i czystość materiału przed wykonaniem jakichkolwiek badań.

 

Podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych używa się rozpuszczalników organicznych (fenol, chloroform, alkohole) oraz soli (np. chlorek lub izotiocyjanian guanidyny), które mogą obniżać wydajność reakcji enzymatycznych takie jak PCR, RT-PCR, znakowanie rybonukleotydów i inne. RNA zanieczyszczone solami także szybciej degraduje (nawet przechowywany w -80 °C!). Dlatego tak ważna jest poprawna analiza jakościowa i ilościowa każdej próbki. Wygodną formą takiej analizy jest pomiar absorbancji przy długości fali 230, 260 i 280nm. Obecnie większość laboratoriów dysponuje spektrofotometrami kroplowymi, które mierzą te parametry w objętościach poniżej 1,5 mikrolitra. Sekretem ich precyzji jest pomiar absorbancji przy dwóch długościach drogi optycznej (w kropli zawieszonej i ściśniętej/rozciągniętej) i ich normalizacja. Oprogramowanie spektrofotometrów kroplowych pozwala na automatyczne przeliczenie absorbancji na stężenie i tzw. „czystość białkową” oraz „czystość organiczną”. Możemy także obejrzeć wykresy absorbancji dla pojedynczej lub serii prób, co jest bardzo pomocne przy ustalaniu źródła zanieczyszczenia kwasów nukleinowych.

 

Wykonanie pomiaru:

1. Próbkę DNA/ RNA przed pomiarem rozmrozić. Bezpośrednio przed pomiarem zvortexować lub przepipetować góra-dół kilkukrotnie, aby ją dobrze wymieszać.

2. W menu urządzenia wybrać odpowiednią opcję (dsDNA, ssDNA, RNA). Opcje różnią się wartością  jednostkowej absorbancji przyjmowaną w przeliczeniu na stężenie, należy o tym pamiętać!

3. Przygotować wodę dejonizowaną (do inicjalizacji) oraz bufor, w którym rozpuszczany był kwas nukleinowy (próba zerowa używana jako kalibrator), o ile urządzenie tego wymaga. Inicjalizację i kalibrację wykonać nakrapiając taką samą objętość płynu z jakiej będziemy korzystać podczas pomiarów. Za każdym razem zetrzeć chusteczką/ bibułąokienko spektrofotometru.

4. Nałożyć odpowiednią objętość próbki na okienko, uważając na ewentualne bąbelki powietrza, które mogą zafałszować pomiar. Po wykonaniu pomiaru okienko przetrzeć bibułką- to wystarczy o ile nie będziemy odzyskiwać próbki. Jeżeli musimy zbierać próbkę z powrotem z okienka, dokładnie przemyjmy okienko pomiędzy pomiarami kolejnych próbek- jest to niepolecane z uwagi na ryzyko kontaminacji.

Obraz zawierający tekst, mapa, zrzut ekranu Opis wygenerowany automatycznie

Ryc. 1: Przykład analizy wykonanej na systemie Nanodrop 1000. „Czyste” RNA w zakresie stężeń od 1000 ng/µl (granatowa krzywa) do 3800 ng/µl (ceglasta). Widzimy, że stężenia powyżej 3000 ng/µl (żółta i ceglasta krzywa) są zbyt wysokie, by można było poprawnie oszacować A260. Charakterystyczne jest to, że w przypadku każdej z krzywych absorbancja A230 jest około 2x mniejsza niż A260 – jest to wyznacznik dobrej jakości RNA.

 

Analiza i interpretacja wyniku:

*       Analiza ilościowa: Ilość kwasu nukleinowego jest określana jako stężenie w 1 µl. Zakres stężeń, w którym oznaczenie jest wiarygodne zależy od systemu pomiarowego i rodzaju kwasu nukleinowego, należy sprawdzić to koniecznie w instrukcji użytkowania urządzenia. Powyżej wartości krytycznej DNA lub RNA jest zbyt stężone, by prawidłowo określić jego ilość i wyznaczyć krzywą absorbancji (patrz ryc. 1). Poniżej wartości 10ul znacząca absorbancja tła powoduje przeszacowanie wyniku.

Próbkę o zbyt wysokiej wartości absorbancji rozcieńczamy tym samym buforem, którego używaliśmy podczas izolacji i którym kalibrowaliśmy urządzenie. Przy zbyt niskiej ilości kwasu nukleinowego próbkę zagęszczamy (o ile posiadamy wyparkę) lub przyjmujemy że ma ona stężenie zbyt niskie by je zmierzyć.

*          Analiza jakościowa: maksimum absorbancji dla białek, częstego zanieczyszczenia DNA przy izolacji manualnej, wynosi 280 nm, zaś zanieczyszczenia organiczne przyjmują najwyższą absorbancję poniżej 240 nm lub powyżej 280nm. Przyjęto arbitralnie 230nm jako długość fali dobrze określającą stopień zanieczyszczeń rozpuszczalnikami organicznymi.

*          Miarą stopnia czystości kwasów nukleinowych  jest stosunek A260/230 oraz A260/280. Przyjmuje się, że „czyste” DNA lub RNA ma A260/280>1,8 i A260/230>1,8. Idealnie czyste RNA rozpuszczone w wodzie DEPC może mieć A260/230 nawet ok. 2,2. Na dokładną wartość tego parametru nieznacznie wpływa użyty bufor, ale generalnie parametry dobrze wyizolowanego DNA lub RNA oscylują wokół 1,8 – 2,05. Najprościej rzecz ujmując oznacza to, że absorbancja przy maksimum dla kwasów nukleinowych (A260) jest 2x większa niż absorbancja tła i zanieczyszczeń.

*          Krytyczne dla reakcji enzymatycznych są wartości A260/280 i A260/230<1,4. Niższe wartości mogą spowodować bardzo kiepskie wyniki amplifikacji np. metodą Real-Time PCR, czy też powodować słabe wyznakowanie sond do mikromacierzy lub otrzymanie niskiej jakości biblioteki do NGS.  Próbki o A260/230<1 powinny zostać doczyszczone lub trafić do kosza.

 

Rodzaje zanieczyszczeń

*        Zanieczyszczenie fenolem powodują wzrost absorbancji w zakresie 200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Obraz (w przypadku ryciny 3 dotyczy próbek znaczonych strzałką, oprócz jasnoniebieskiej) jest podobny jak w przypadku zanieczyszczenia solami chaotropowymi. Takie DNA/RNA nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych. A260/230 i A260/280 mogą przyjmować zaskakujące wartości (>2. lub <1,4 w zależności od stężenia fenolu i towarzyszących zanieczyszczeń, np. chloroformu i alkoholu izoamylowego)

Obraz zawierający tekst, mapa Opis wygenerowany automatycznie

Ryc. 2: Zanieczyszczenie fenolem (czerwona strzałka) oraz niepoprawna aplikacja próbki na okienko (oznaczone czarnymi strzałkami). Przykład analizy wykonanej na systemie Nanodrop 1000.

 

*          Zanieczyszczenie izotiocyjanianem lub chlorkiem guanidyny – widoczne na ryc. 2 (krzywa czarna i jasnozielona). Wydatny pik przy długości fali 230nm i towarzyszące mu przesunięcie absorbancji DNA/RNA w prawo w kierunku 270nm to cechy charakterystyczne tej kontaminacji. Taka próbka w żadnym wypadku nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych, sole izotiocyjanianu są silnymi zwiazkami chaotropowymi i unieczynniają enzymy! Najczęściej oba parametry A260/A280 i A260/A230 osiągają wartości <1,4.

Obraz zawierający tekst, mapa Opis wygenerowany automatycznie

Ryc. 3: Zanieczyszczenie solami chaotropowymi. Charakterystyczna „skocznia mamucia” na wykresie absorbancji. Przykład analizy wykonanej na systemie Nanodrop 1000.

 

*          Zanieczyszczenie DTT lub innymi detergentami: może powodować wzrost absorbancji w zakresie długości fali >280nm.

*          Zanieczyszczenie białkami – powodują wzrost absorbancji w zakresie 200-230 nm  i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Przy niewielkim zanieczyszczeniu (<0,1%) możemy nie obserwować „górki” z prawej strony wykresu, a jedynie niewielki spadek A260/280.

Obraz zawierający tekst, mapa Opis wygenerowany automatycznie

Ryc 4. Wysokie zanieczyszczenie białkowe i organiczne DNA we wszystkich próbkach. Przykład analizy wykonanej na systemie Nanodrop 1000.

 

*          Zanieczyszczenie etanolem i/lub izopropanolem – nie obserwuje się znaczącej zmiany absorbancji, szczególnie w roztworach zbuforowanych. W wodzie parametr A260/230 może być nieznacznie obniżony. Przy niewielkiej domieszce etanolu reakcje enzymatyczne nie są mocno spowalniane, warto jednak przywiązywać wagę do dokładnego wysuszenia pelletu przed rozpuszczeniem, ponieważ zanieczyszczenia etanolem i izopropanolem są niewykrywalne spektrofotometrycznie.

*          Zanieczyszczenie DNA przez RNA (i vice versa)– oba kwasy nukleinowe są koekstrahowane i zazwyczaj występują razem po izolacji. Mają także bardzo zbliżoną pochłanialność i emisję światła, więc są nierozróżnialne spektrofotometrycznie. W przypadku konieczności pozbycia się DNA z RNA musimy wykonać trawienie próbek DNAzą I. Nie ma z reguły konieczności trawienia RNA jako zanieczyszczenia DNA.

 

 

Troubleshooting

*          A260/230 jest >2,3

Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do rozpuszczenia próbek (np. woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez spektrofotometr. Objawia się to poszarpaną krzywą (ryc. 2)

*          Absorbancja A260 jest ujemna.

Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez spektrofotometr. (ryc. 2)

*          Urządzenie nie potrafi wyznaczyć absorbancji

Próbka zawieszona jest w pieniącym się bądź lepkim buforze, nakropiono zbyt mało próbki bądź poza strefą pomiaru (okienko jest puste).

*          Używam QiaSymphony i otrzymuję bardzo zanieczyszczone 

Obraz zawierający wewnątrz, ściana, siedzi Opis wygenerowany automatycznie

DNA!

Niektóre bufory są konserwowane imidazolem, który interferuje podczas pomiaru spektrofotometrycznego. Należy skorzystać z innej metody oceny stężenia i czystości (np. Qubit i/lub elektroforeza).

Ryc5.  Zbliżenie okienka pomiarowego urządzenia Nanodrop1000.

 

Podziel się: